S2(R1) (MHLW Step 5)S2(R1) (ICH Step 4)

薬食審査発0920 第２号
平成２４年９月２０日

ICH Harmonised Tripartite Guideline
Current Step 4 version
dated 9 November 2011

1.1 ガイドラインの目的
このガイダンスはICH ガイダンスS2A 及びS2B に替わるもので、両者を1 つにまとめたものである。改訂の目的は、ヒトに対するリスクを予測するための遺伝毒性試験の標準的組合せを最適化すること、及び結果の解釈のためのガイダンスを提供することであり、遺伝子の変化に基づく発がん性のリスク評価の精度向上を最終的な目的としている。本改訂ガイダンスは、国際的に合意された追加試験の基準並びに標準的組合せのin vitro 及びin vivo 遺伝毒性試験における陽性結果の解釈（妥当性のない[non-relevant]所見の評価を含む。）について述べ、医薬品として開発される製品についてのみ適用される。

1.1 Objectives of the Guideline
This guidance replaces and combines the ICH S2A and S2B Guidelines. The purpose of the revision is to optimize the standard genetic toxicology battery for prediction of potential human risks, and to provide guidance on interpretation of results, with the ultimate goal of improving risk characterization for carcinogenic effects that have their basis in changes in the genetic material. The revised guidance describes internationally agreed upon standards for follow-up testing and interpretation of positive results in vitro and in vivo in the standard genetic toxicology battery, including assessment of non-relevant findings. This guidance is intended to apply only to products being developed as human pharmaceuticals.

1.2 背景
最新の経済開発協力機構（OECD）ガイドラインの勧告及び「遺伝毒性試験に関する国際ワークショップ（IWGT）」の報告書が適切に考慮されてきた。このガイダンスで述べるように、OECD及びIWGT による勧告とは、いくつかの相違点がある。相違点は本ガイドラインを優先する。
このガイダンスに続く注記は他のICH ガイダンスと併せて適用すべきである。

1.2. Background
The recommendations from the latest Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) guidelines and the reports from the International Workshops on Genotoxicity Testing (IWGT) have been considered where relevant. In certain cases, there are differences from the OECD or IWGT recommendations, which are noted in the text. The following notes for guidance should be applied in conjunction with other ICH guidances.

1.3 ガイドラインの適用範囲
このガイダンスは新規の「低分子」医薬品の試験に関するものであり、生物学的製剤には適用されない。臨床開発段階における遺伝毒性試験実施のタイミングについては、ICH M3(R2)ガイダンスで推奨時期が示されている。

1.3. Scope of the Guideline
The focus of this guidance is testing of new “small molecule” drug substances, and the guidance does not apply to biologics. Advice on the timing of the studies relative to clinical development is provided in the ICH M3 (R2) guidance.

1.4 一般原則
遺伝毒性試験は、種々の機序で遺伝的な傷害を引き起こす物質を検出するために考案されたin vitro 及びin vivo 試験と定義することができる。これらの試験は、DNA 損傷及びその損傷が固定された遺伝的傷害を検出する。DNA に対する遺伝的傷害とは、遺伝子突然変異、より広範な染色体の異常又は組換えのことであり、これらは後世代への遺伝的影響の本質であり、また、がん化における多段階過程の一部を担っていると一般的に考えられている。染色体の数的変化もまた腫瘍発生に関連しているとともに、生殖細胞における数的染色体異常誘発能を持つ可能性があることを示している。このような傷害を検出する試験で陽性となった物質は、ヒトに対する発がん物質や変異原物質である可能性がある。特定の化学物質の曝露とヒトでの発がん性の相関が証明されているが、遺伝性疾患について同様の関係を証明することは困難である。そのため、遺伝毒性試験は主としてがん原性を予測するために用いられてきた。しかしながら、生殖細胞系における突然変異はヒトの疾患と明確に関係していることから、ある物質が後世代への影響を引き起こすことが疑われた場合は、がん原性が疑われたのと同様に重大であると考えられる。また、遺伝毒性試験の結果はがん原性試験結果の解釈に有用である。

1.4 General Principles
Genotoxicity tests can be defined as in vitro and in vivo tests designed to detect compounds that induce genetic damage by various mechanisms. These tests enable hazard identification with respect to damage to DNA and its fixation. Fixation of damage to DNA in the form of gene mutations, larger scale chromosomal damage or recombination is generally considered to be essential for heritable effects and in the multi-step process of malignancy, a complex process in which genetic changes might possibly play only a part. Numerical chromosome changes have also been associated with tumorigenesis and can indicate a potential for aneuploidy in germ cells. Compounds that are positive in tests that detect such kinds of damage have the potential to be human carcinogens and/or mutagens. Because the relationship between exposure to particular chemicals and carcinogenesis is established for humans, whilst a similar relationship has been difficult to prove for heritable diseases, genotoxicity tests have been used mainly for the prediction of carcinogenicity. Nevertheless, because germ line mutations are clearly associated with human disease, the suspicion that a compound might induce heritable effects is considered to be just as serious as the suspicion that a compound might induce cancer. In addition, the outcome of genotoxicity tests can be valuable for the interpretation of carcinogenicity studies.

2.1 理論的根拠
医薬品の申請のためには遺伝毒性の総合的な評価が要求される。広範なレビューにより、細菌を用いる復帰突然変異（エームス）試験で陽性の化学物質の多くが、げっ歯類での発がん物質であることが示されている。ほ乳類培養細胞を用いるin vitro 試験を加えることによって、げっ歯類に対する発がん物質の検出感度が増し、検出される遺伝的傷害の範囲が広がるが、これにより逆に予測の特異性が減少する；すなわち、げっ歯類での発がん性と関連しない陽性結果が増加する。しかしながら、1 つの試験でがん原性に関連するすべての遺伝毒性機序を検出できないことから、組合せによる試験の実施は依然として妥当なものと考えられる。
試験の標準的組合せは次のとおりである。

i. 細菌を用いる復帰突然変異試験での変異原性の評価。この試験は妥当性のある遺伝的変化を検出し、げっ歯類及びヒト遺伝毒性発がん物質の大部分を検出することができるとされている。
ii. ほ乳類細胞でのin vitro 及び／又はin vivo 遺伝毒性の評価。ここでの遺伝毒性は以下のように評価されるべきである。

In vitro 分裂中期染色体異常試験、in vitro 小核試験（注1 参照）及びL5178Y 細胞を用いるマウスリンフォーマTk（チミジンキナーゼ）試験（MLA）の3 種類の in vitro ほ乳類細胞試験系が広く使用されており、それらの信頼性は十分に保証されていると考えられる。これら3 つの試験は同程度の検出力を持つと考えられており、このガイドラインで推奨されているプロトコールを用い、標準的組合せ試験として他の遺伝毒性試験と一緒に行う場合は、染色体傷害の検出に関しては互換性がある。
In vivo で変異原性を示し、in vitro で変異原性陰性の化合物が存在すること（注2 参照）、及び遺伝毒性の評価に、吸収、分布、代謝及び排泄などの要素を加味した試験法を加えることが望ましいことから、in vivo 遺伝毒性試験が標準的組合せに加えられている。この理由により、現時点では、末梢血若しくは骨髄中の赤血球の小核又は骨髄における分裂中期細胞の染色体異常のいずれかが評価の対象として選択される（注3 参照）。被験物質で処理した動物の培養リンパ球もまた細胞遺伝学的解析に用いることができるが、その方法はまだ一般的ではない。
分裂中期細胞を用いるin vitro 及びin vivo の染色体異常試験は、染色体の安定性を変化させる様々な異常を検出することができる。染色分体又は染色体が切断されることで、無動原体染色体断片が生じ、これにより小核が形成される。したがって、染色体異常や小核を検出する試験のいずれも染色体の構造異常の検出に適切であると考えられている。小核はまた、分裂後期における1 本以上の染色体の極への移動異常によっても形成されるため、小核試験は染色体の数的異常誘発物質を検出できる可能性がある。MLA はチミジンキナーゼ遺伝子の変異を検出する系であるが、この変異は遺伝子突然変異と染色体異常のいずれの機序によっても発生する。MLA はまた染色体の損失も検出可能であることが知られている。
いくつかの追加のin vivo 試験は組合せ試験にも用いることができる。また、in vitro 及びin vivo試験結果を評価する際の証拠の重み付け（weight of evidence,；WOE）を得るための追加試験としても有用である（下記参照）。評価対象となる試験が十分理にかない、適正な方法により実施され、かつ、標的組織での曝露が証明されていれば（4.4 項参照）、そのin vivo 試験（通常2 試験）の陰性結果は、懸念すべき遺伝毒性リスクがないことを示す十分な証明となる。

2.1 Rationale
Registration of pharmaceuticals requires a comprehensive assessment of their genotoxic potential. Extensive reviews have shown that many compounds that are mutagenic in the bacterial reverse mutation (Ames) test are rodent carcinogens. Addition of in vitro mammalian tests increases sensitivity for detection of rodent carcinogens and broadens the spectrum of genetic events detected, but also decreases the specificity of prediction; i.e., increases the incidence of positive results that do not correlate with rodent carcinogenicity. Nevertheless, a battery approach is still reasonable because no single test is capable of detecting all genotoxic mechanisms relevant in tumorigenesis.

The general features of a standard test battery are as follows:
i. Assessment of mutagenicity in a bacterial reverse gene mutation test. This test has been shown to detect relevant genetic changes and the majority of genotoxic rodent and human carcinogens.
ii. Genotoxicity should also be evaluated in mammalian cells in vitro and/or in vivo as follows.

Several in vitro mammalian cell systems are widely used and can be considered sufficiently validated: The in vitro metaphase chromosome aberration assay, the in vitro micronucleus assay (Note 1) and the mouse lymphoma L5178Y cell Tk (thymidine kinase) gene mutation assay (MLA). These three assays are currently considered equally appropriate and therefore interchangeable for measurement of chromosomal damage when used together with other genotoxicity tests in a standard battery for testing of pharmaceuticals, if the test protocols recommended in this Guideline are used.
In vivo test(s) are included in the test battery because some agents are mutagenic in vivo but not in vitro (Note 2) and because it is desirable to include assays that account for such factors as absorption, distribution, metabolism and excretion. The choice of an analysis either of micronuclei in erythrocytes (in blood or bone marrow), or of chromosome aberrations in metaphase cells in bone marrow, is currently included for this reason (Note 3). Lymphocytes cultured from treated animals can also be used for cytogenetic analysis, although experience with such analyses is less widespread.
In vitro and in vivo tests that measure chromosomal aberrations in metaphase cells can detect a wide spectrum of changes in chromosomal integrity. Breakage of chromatids or chromosomes can result in micronucleus formation if an acentric fragment is produced; therefore assays that detect either chromosomal aberrations or micronuclei are considered appropriate for detecting clastogens. Micronuclei can also result from lagging of one or more whole chromosome(s) at anaphase and thus micronucleus tests have the potential to detect some aneuploidy inducers. The MLA detects mutations in the Tk gene that result from both gene mutations and chromosome damage. There is some evidence that MLA can also detect chromosome loss.
There are several additional in vivo assays that can be used in the battery or as follow-up tests to develop weight of evidence in assessing results of in vitro or in vivo assays (see below). Negative results in appropriate in vivo assays (usually two), with adequate justification for the endpoints measured, and demonstration of exposure (see Section 4.4) are generally considered sufficient to demonstrate absence of significant genotoxic risk.

2.2 標準的組合せの2 つのオプションの詳細

標準的組合せに関する以下の2 つのオプションは同等に適切と判断される（注4 参照）。

オプション1
i. 細菌を用いる復帰突然変異試験
ii. 染色体傷害を検出するための細胞遺伝学的試験（in vitro 分裂中期での染色体異常試験又はin vitro 小核試験）又はマウスリンフォーマTk 試験
iii. In vivo 遺伝毒性試験。一般には、げっ歯類造血細胞での染色体傷害、すなわち小核又は分裂中期細胞の染色体異常を検出する試験

オプション2
i. 細菌を用いる復帰突然変異試験
ii. 2 種類の異なる組織におけるin vivo 遺伝毒性試験。一般的には、げっ歯類造血細胞を用いる小核試験及び2 つ目のin vivo 試験。他に適切な方法がない限り、一般的には肝臓のDNA 鎖切断を検出する試験が勧められる（下記及び4.2 項、注12 参照）

オプション1 は、ICH ガイダンスS2A 及びB に準拠していることもあり、主に歴史的な経験で構成されている。しかしながら、オプション1 と2 が同等に受け入れられると考える理由は次のとおりである。In vitro ほ乳類培養細胞試験で陽性で、適切な組織で十分な曝露量が得られている適正に実施された2 種のin vivo 試験で明らかな陰性の場合は、in vivo では遺伝毒性を示さないことの十分な証拠と考えられる（5.4.1.1 項以降参照）。したがって、初めから2 種のin vivo 試験を実施するオプションは、in vitro の陽性結果の追加検討と同等である（注4 参照）。
標準的組合せの両オプションは、in vivo の短期又は反復投与どちらの試験方法にも組み入れて使うことができる。反復投与する場合、科学的に正しければ一般毒性試験に遺伝毒性の指標を組み込むことを考慮すべきである。1 つのin vivo 試験を独立して短期投与で行う場合には2 つ以上の指標を組み込むことが望まれる。多くの場合、試験開始前に反復投与毒性試験の投与量が適切かどうかの十分な情報が得られていると考えられるので、短期投与が適切かあるいは反復投与に組み入れるのがよいかの判断に使える。
このガイダンスに従い実施され、評価されたいずれかのオプションの標準的試験の組合せにおいて陰性の結果を示す化合物は、通常、遺伝毒性活性を持たないと考えられ、追加試験は必要ない。標準的組合せ試験で陽性の化合物は、その臨床での使用形態にもよるが、より広範な検討をする必要があるものと考えられる（5 項参照）。
オプション2 においてin vivo 評価の第2 の試験として使用できるものは4.2 項に示すような試験があり、これらのいくつかは反復投与毒性試験に組み入れることができる。肝臓は曝露及び代謝能の観点から特に最適な組織であると考えられるが、第2 の組織及び試験法は想定可能な機序、代謝又は曝露情報などの要因を考慮して選択すべきである。
染色体の数的異常に関する情報はin vitro でのほ乳類細胞試験及びin vitro 又はin vivo の小核試験より得ることができる。異数性誘発能を示す指標としては、分裂指数の増加、倍数性及び小核の誘発がある。MLA でも紡錘体阻害剤の検出は可能であるとされている。オプション2 において推奨されるin vivo の細胞遺伝学的試験は、染色体の損失（異数体の可能性）を直接検出することができる小核試験が推奨されるが、染色体異常試験は推奨されない。
ここでは、試験の標準的組合せを提示したが、これは他の遺伝毒性試験が不十分又は不適当であることを意味している訳ではない。追加実施した試験結果は、標準的組合せで得られた試験結果をより詳細に調査するために使用することができる（4.2 及び5 項参照）。必要性が示され、かつ十分に評価されている試験であれば、非げっ歯類を含む代替の試験系も利用可能である。
標準的組合せを構成する試験において、技術的な理由で試験が実施できない場合には、有用性が確認された代替試験を十分な科学的正当性を持つものとして利用することができる。

2.2 Description of the Two Options for the Standard Battery
The following two options for the standard battery are considered equally suitable (Note 4):

Option 1
i. A test for gene mutation in bacteria.
ii. A cytogenetic test for chromosomal damage (the in vitro metaphase chromosome aberration test or in vitro micronucleus test), or an in vitro mouse lymphoma Tk gene mutation assay.
iii. An in vivo test for genotoxicity, generally a test for chromosomal damage using rodent hematopoietic cells, either for micronuclei or for chromosomal aberrations in metaphase cells.

Option 2
i. A test for gene mutation in bacteria.
ii. An in vivo assessment of genotoxicity with two different tissues, usually an assay for micronuclei using rodent hematopoietic cells and a second in vivo assay. Typically this would be a DNA strand breakage assay in liver, unless otherwise justified (see below; also Section 4.2 and Note 12).

There is more historical experience with Option 1, partly because it is based on S2A and B. Nevertheless, the reasoning behind considering Options 1 and 2 equally acceptable is as follows: When a positive result occurs in an in vitro mammalian cell assay, clearly negative results in two well conducted in vivo assays, in appropriate tissues and with demonstrated adequate exposure, are considered sufficient evidence for lack of genotoxic potential in vivo (see Section 5.4.1.1 below). Thus a test strategy in which two in vivo assays are conducted is the same strategy that would be used to follow up a positive result in vitro (Note 4).
Under both standard battery options, either acute or repeat dose study designs in vivo can be used. In case of repeated administrations, attempts should be made to incorporate the genotoxicity endpoints into toxicity studies, if scientifically justified. When more than one endpoint is evaluated in vivo it is preferable that they are incorporated into a single study. Often sufficient information on the likely suitability of the doses for the repeat-dose toxicology study is available before the study begins and can be used to determine whether an acute or an integrated test will be suitable.
For compounds that give negative results, the completion of either option of the standard test battery, performed and evaluated in accordance with current recommendations, will usually provide sufficient assurance of the absence of genotoxic activity and no additional tests are warranted. Compounds that give positive results in the standard test battery might, depending on their therapeutic use, need to be tested more extensively (see Section 5).
There are several in vivo assays that can be used as the second part of the in vivo assessment under Option 2 (see Section 4.2), some of which can be integrated into repeat-dose toxicology studies. The liver is typically the preferred tissue because of exposure and metabolizing capacity, but choice of in vivo tissue and assay should be based on factors such as any knowledge of the potential mechanism, of the metabolism in vivo, or of the exposed tissues thought to be relevant.
Information on numerical changes can be derived from the mammalian cell assays in vitro and from the micronucleus assays in vitro or in vivo. Elements of the standard protocols that can indicate such potential are elevations in the mitotic index, polyploidy induction and micronucleus evaluation. There is also experimental evidence that spindle poisons can be detected in MLA. The preferred in vivo cytogenetic test under Option 2 is the micronucleus assay, not a chromosome aberration assay, to include more direct capability for detection of chromosome loss (potential for aneuploidy).
The suggested standard set of tests does not imply that other genotoxicity tests are generally considered inadequate or inappropriate. Additional tests can be used for further investigation of genotoxicity test results obtained in the standard battery (see Sections 4.2 and 5). Alternative species, including non-rodents, can also be used if indicated, and if sufficiently validated.
Under conditions in which one or more tests in the standard battery cannot be employed for technical reasons, alternative validated tests can serve as substitutes provided sufficient scientific justification is given.

2.3 試験組合せの変更
下記のような状況下にあっては、標準的組合せを変更することが推奨される場合もある。

2.3.1 探索的臨床試験
特定の探索的臨床試験に関しては、in vivo での最高投与量設定に相応の理由があれば、限られた遺伝毒性試験又は異なる判断基準を適用してもよい（ICH M3(R2)ガイダンス参照）。

2.3.2 細菌に毒性を示す化合物

細菌に強い毒性を示す化合物（例えばある種の抗生物質）に関しては、毒性が発現しない低濃度で変異原性が誘発されることもあるため、細胞毒性を示す化合物がほ乳類細胞で試験されるのと同様に、細菌を用いる復帰突然変異（エームス）試験は依然実施すべきである。さらに、このような場合には、in vitro のほ乳類培養細胞を用いる試験のいずれか1 つを合わせて実施すべきである。すなわちオプション1 を選択する。

2.3.3 構造的に遺伝毒性が予想される化合物
多くの「警告部分構造」は細菌の変異原性に関して定義されているため、構造的に遺伝毒性が予想される化合物（注5 参照）は、通常、標準的組合せ試験により検出可能である。少数の化合物クラスは、細菌を用いる遺伝子突然変異試験よりもほ乳類の培養細胞を用いる染色体異常試験で容易に検出できることが知られている。したがって、警告部分構造を有する化合物における標準的組合せにおける陰性結果は、遺伝毒性を有していない十分な保証となると考えられる。しかしながら、ある種の特異的な警告部分構造を有する化合物群に対しては、標準プロトコールを適切に変更することが望ましい（注5 参照）。追加試験とするかプロトコールの変更とするかの選択は、問題となっている警告部分構造を有する化学物質に関する化学的性質、既知の反応性及び代謝データに基づいて選択する。

2.3.4 In vivo 試験系の利用の限界
骨髄、血液又は肝臓を用いるin vivo 試験を実施しても有用な情報が得られない化合物がある。
トキシコキネティクスやファーマコキネティクスのデータから、全身での体内吸収がなく、標的臓器に到達できないような化合物がそれに相当する。例として、ある種の造影剤、アルミニウムを主成分とする制酸剤、いくつかの吸入投与剤及び皮膚又は他の局所適用の医薬品があげられる。
投与経路を変更しても標的臓器が十分に曝露されず、最も曝露される組織において適切な遺伝性毒性試験が実施できない場合には、in vitro 試験系のみでの評価が基本的に適切であるかもしれない。汎用されている試験系ではないものの、これらの試験により、曝露部位に対する遺伝毒性評価を適切に実施することは可能である（注6 参照）。

2.3 Modifications to the Test Battery
The following sections describe situations where modification of the standard test battery might be advisable.

2.3.1 Exploratory Clinical Studies
For certain exploratory clinical studies, fewer genotoxicity assays or different criteria for justification of the maximum dose in vivo might apply (see ICH M3(R2) guidance).

2.3.2 Testing Compounds that are Toxic to Bacteria
In cases where compounds are highly toxic to bacteria (e.g., some antibiotics), the bacterial reverse mutation (Ames) test should still be carried out, just as cytotoxic compounds are tested in mammalian cells, because mutagenicity can occur at lower, less toxic concentrations. In such cases, any one of the in vitro mammalian cell assays should also be done, i.e., Option 1 should be followed.

2.3.3 Compounds Bearing Structural Alerts for Genotoxic Activity
Structurally alerting compounds (Note 5) are usually detectable in the standard test battery since the majority of “structural alerts” are defined in relation to bacterial mutagenicity. A few chemical classes are known to be more easily detected in mammalian cell chromosome damage assays than bacterial mutation assays. Thus negative results in either test battery with a compound that has a structural alert is usually considered sufficient assurance of a lack of genotoxicity. However, for compounds bearing certain specific structural alerts, modification to standard protocols can be appropriate (Note 5). The choice of additional test(s) or protocol modification(s) depends on the chemical nature, the known reactivity and any metabolism data on the structurally alerting compound in question.

2.3.4 Limitations to the Use of In Vivo Tests
There are compounds for which many in vivo tests (typically in bone marrow, blood or liver) do not provide additional useful information. These include compounds for which data on toxicokinetics or pharmacokinetics indicate that they are not systemically absorbed and therefore are not available to the target tissues. Examples of such compounds are some radioimaging agents, aluminum based antacids, some compounds given by inhalation, and some dermally or other topically applied pharmaceuticals. In cases where a modification of the route of administration does not provide sufficient target tissue exposure, and no suitable genotoxicity assay is available in the most exposed tissue, it might be appropriate to base the evaluation only on in vitro testing. In some cases evaluation of genotoxic effects at the site of contact can be warranted, although such assays have not yet been widely used (Note 6).

2.4 生殖細胞に対する変異原性物質の検出
比較検討から、ほとんどの生殖細胞変異原物質は、体細胞を用いる試験で遺伝毒性が検出されることが定性的に示されている。したがって、体細胞を用いるin vivo 遺伝毒性試験の陰性結果は生殖細胞に影響がないことを示していると考えることができる。

2.4 Detection of Germ Cell Mutagens
Results of comparative studies have shown that, in a qualitative sense, most germ cell mutagens are likely to be detected as genotoxic in somatic cell tests so that negative results of in vivo somatic cell genotoxicity tests generally indicate the absence of germ cell effects.

3.1 試験の繰り返し及び解釈
実験結果の再現性は、新しい手法による研究や、予期しない結果が得られた場合に必須の要素である。しかしながら、医薬品のために標準化され汎用されている定型的な遺伝毒性試験では、繰り返しを必要としない場合がある。これらの試験は特性が明確であり、また十分な内部コントロールを有しているので、明らかな陽性又は陰性の場合、試験の繰り返しは通常必要とされない。
理想的には、試験結果は明らかな陽性又は明らかな陰性と確定すべきである。しかしながら、時には試験結果が陽性や陰性の判定基準を満たさないことがあり、その場合には「不確か(equivocal)」とせざるを得ない。このような場合には、統計学的手法の適用が解釈に役立つが、適切な生物学的解釈が極めて重要である。「不確か」な場合、再試験において、（i）明らかな陽性結果を示せば総合して陽性、（ii）陰性結果を示せば再現性がないため総合して陰性又は（iii）再び「不確か」を示せば、最終結論も「不確か」となる可能性がある。

3.1 Test Repetition and Interpretation
Reproducibility of experimental results is an essential component of research involving novel methods or unexpected findings; however, the routine testing of drugs with standard, widely used genotoxicity tests often does not call for replication. These tests are sufficiently well characterized and have sufficient internal controls that repetition of a clearly positive or negative assay is not usually warranted. Ideally it should be possible to declare test results clearly negative or clearly positive. However, test results sometimes do not fit the predetermined criteria for a positive or negative call and therefore are declared “equivocal”. The application of statistical methods can aid in data interpretation; however, adequate biological interpretation is of critical importance. An equivocal test that is repeated might result in (i) a clearly positive outcome, and thus an overall positive result; (ii) a negative outcome, so that the result is not reproducible and overall negative, or (iii) another equivocal result, with a final conclusion that remains equivocal.

3.2 細菌を用いる遺伝子突然変異試験
OECD ガイドライン（1997）及びIWGT 報告書（Gatehouse ら、1994）にプロトコールに関する助言が記述されている。

3.2.1 最高用量の選択
最高用量
溶解性又は菌の生育阻害が問題とならない場合、最高用量は5000 μg/plate（被験物質が液体の場合、5 μL/plate）とする。
溶解性の限界
菌の生育阻害がなく、また、最高用量が5000 μg/plate（被験物質が液体の場合、5 μL/plate）以下という条件下では、析出物が変異コロニーの検出を妨げない限り、析出する用量においても測定する。菌の生育阻害が観察されない場合は、析出する最低用量を最高用量とすべきである。もし、用量相関的に菌の生育阻害又は復帰変異コロニーの増加が認められた場合には、溶解性に関係なく最高用量は以下の基準に基づくべきである。
生育阻害による制限
エームス試験では、生育阻害の現れる用量を最高用量とし、最高濃度5000 μg/plate を超えない用量とする。生育阻害は復帰変異コロニー数の減少や背景の細菌の生育 （background lawn）の透明化（clearing）又は減少によって検出されることがある。

3.2.2 試験のデザイン及びプロトコール
塩基対置換及びフレームシフト突然変異の検出にOECD が推奨する試験菌株のセットは以下のとおりである。
• ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）TA98
• ネズミチフス菌TA100
• ネズミチフス菌TA1535
• ネズミチフス菌TA1537、TA97 又はTA97a
• ネズミチフス菌TA102、大腸菌（Escherichia coli）WP2uvrA 又は大腸菌WP2uvrA/pKM101
OECD ガイドライン及びIWGT 報告書との相違は、細菌を用いる復帰突然変異（エームス）試験については、結果が明らかに陰性又は陽性で、代謝活性化系の存在下及び非存在下ですべての試験菌株を含み、最高用量の選択基準を満たす用量範囲並びに適切な陽性及び陰性対照を設置して実施した場合には、医薬品の遺伝毒性試験の経験に基づき、1 試験で十分であると考えられるという点である。また、医薬品の試験ではプレート法及びプレインキュベーション法はともに受け入れ可能である（注7 参照）。不確か又は弱い陽性結果が得られた場合には、用量レベルの間隔を変更するなどプロトコールを最適化した再試験を実施することが望ましい。

3.2 Recommended Protocol for the Bacterial Mutation Assay
Advice on the protocols is given in the OECD guideline (1997) and the IWGT report (Gatehouse et al., 1994).

3.2.1 Selection of Top Dose Level
Maximum dose level
The maximum dose level recommended is 5000 μg/plate (or 5 μL/plate for liquid test substance) when not limited by solubility or cytotoxicity.

Limit of solubility
For bacterial cultures, precipitating doses are scored provided precipitate does not interfere with scoring, toxicity is not limiting, and the top concentration does not exceed 5000 μg/plate (or 5 μL/plate for liquid test substance). If no cytotoxicity is observed, then the lowest precipitating dose should be used as the top dose scored. If dose related cytotoxicity or mutagenicity is noted, irrespective of solubility, the top dose scored should be based on cytotoxicity as described below.

Limit of cytotoxicity
In the Ames test, the doses scored should show evidence of significant toxicity, but without exceeding a top dose of 5000 μg/plate. Toxicity might be detected by a reduction in the number of revertants, and/or clearing or diminution of the background lawn.

3.2.2 Study Design/Test Protocol
The recommended set of bacterial strains (OECD) includes those that detect base substitution and frameshift mutations as follows:
• Salmonella typhimurium TA98;
• Salmonella typhimurium TA100;
• Salmonella typhimurium TA1535;
• either Salmonella typhimurium TA1537 or TA97 or TA97a;
• and either Salmonella typhimurium TA102 or Escherichia coli WP2 uvrA or Escherichia coli WP2 uvrA (pKM101).

One difference from the OECD and IWGT recommendations is that, based on experience with testing pharmaceuticals, a single bacterial mutation (Ames) test is considered sufficient when it is clearly negative or positive, and carried out with a fully adequate protocol including all strains with and without metabolic activation, a suitable dose range that fulfills criteria for top dose selection, and appropriate positive and negative controls. Also, for testing pharmaceuticals, either the plate incorporation or the pre-incubation method is considered appropriate for this single experiment (Note 7). Equivocal or weak positive results might indicate that it would be appropriate to repeat the test, possibly with a modified protocol such as appropriate spacing of dose levels.

3.3 ほ乳類細胞を用いる試験
OECD ガイドライン（1997）及びIWGT の公表文献（例；Kirsch-Volders ら、2003；Moore ら、2006）にプロトコールに関する助言が記載されている。MLA の結果の解釈についての助言も、総合的評価ファクター（global evaluation factor）の使用も含め記載されている（Moore ら、2006）。
ここでは医薬品の試験について推奨されるものと他とのいくつかの違い、特に最高用量の選択について述べる（詳細は下記参照）。

3.3.1 最高濃度の選択
最高濃度
溶媒若しくは培養液中の溶解性又は細胞毒性が問題とならない場合は、最高濃度の上限は1mM 又は0.5 mg/mL のいずれか低い濃度が推奨される（注8 参照）。
溶解性の限界
難溶又は不溶の場合において細胞毒性が問題とならなければ、最高濃度は培養中で沈殿がみられ、観察を妨げない最も低い濃度とする。沈殿の評価は、肉眼観察又は光学顕微鏡による観察などで行う。沈殿が最初から継続してみられるのか、又は培養中に新たに生じるのか処理の終了まで観察し、記載する。
細胞毒性
分裂中期の染色体異常又は小核を調べるin vitro の細胞遺伝学的試験では、細胞毒性は、細胞増殖抑制が約50％を超えないようにする（注9、10 参照）。MLA では、最高用量において細胞毒性が80～90%（10～20%RTG）になるようにする（注9 参照）。

3.3.2 試験デザイン及びプロトコール
In vitro の分裂中期細胞における染色体損傷の細胞遺伝学的評価には、陽性及び陰性対照を設けるとともに、代謝活性化系の存在下及び非存在下での試験の実施が必要である。被験物質の処理は3～6 時間とし、処理開始から約1.5 正常細胞周期後に標本を作製する。代謝活性化系の存在下及び非存在下の短時間処理の両方で陰性結果又は不確かな結果の場合には、代謝活性化系の非存在下で約1.5 正常細胞周期の連続処理が必要である。 In vitro の小核試験にも同じ原則が適用される。ただし、細胞の分裂期を終了させ、次の間期に入らせるため、一般に被験物質の処理開始から1.5～2 正常細胞周期後に標本を作製する。これらのin vitro 細胞遺伝学的試験では、ヌクレオシドアナログ及びニトロソアミンのようなある種の化学物質に対しては、処理時間を長くするか、あるいは採取時間を遅らせるか、又は回復期間を設けるなどのプロトコールの変更によって容易に検出できる場合もある。染色体異常試験では、分裂中期細胞の出現率とともに倍数体（核内倍加を含む。）細胞の出現率を記録することによって倍数性の情報を得ておくべきである。
MLA では、適切な陽性及び陰性対照を設け、代謝活性化系の存在下及び非存在下で試験を実施する。被験物質の処理は3～4 時間とする。代謝活性化系の存在下及び非存在下の短時間処理の両方において陰性結果あるいは不確かな結果の場合には、代謝活性化系の非存在下で約24 時間の連続処理を実施すべきである。標準的なMLA では、（i）主として小さなコロニーを誘発する陽性対照を用い、（ii）被験物質が陽性を示した場合、陽性対照、溶媒対照及び被験物質で最大突然変異頻度を示した用量を含む少なくとも1 陽性用量においてコロニーサイズの分類が必要である。
In vitro のほ乳類細胞試験では、上記に概説（例えば異なる処理時間、代謝活性化系の存在下及び非存在下による試験）したように、試験内に再現性をみる要素が組み込まれている。このような試験で明らかに陰性又は陽性の場合には、追加の確認試験は求められない。不確か、又は弱い陽性結果が得られた場合には、処理濃度の間隔を変更するなどプロトコールを最適化した試験の繰り返しが必要となるかもしれない。

3.3.3 陽性対照
同時陽性対照群は重要であるが、遺伝毒性検出のためのin vitro ほ乳類細胞試験は十分に標準化されているため、（非代謝活性化系の試験と同時に行うのであれば）代謝活性化系の活性確認と試験系の反応性を証明するための代謝活性化系の存在下での陽性対照のみでよい。

3.3 Recommended Protocols for the Mammalian Cell Assays
Advice on the protocols is given in the OECD guidelines (1997) and the IWGT publications (e.g., Kirsch-Volders et al., 2003; Moore et al., 2006). Advice on interpretation of MLA results is also given (Moore et al., 2006), including use of a global evaluation factor. Several differences from these recommendations are noted here for testing pharmaceuticals, notably for selection of the top concentration. (See details below.)

3.3.1 Selection of Top Concentration
Maximum concentration
The maximum top concentration recommended is 1 mM or 0.5 mg/ml, whichever is lower, when not limited by solubility in solvent or culture medium or by cytotoxicity (Note 8).

Limit of solubility
When solubility is limiting, the maximum concentration, if not limited by cytotoxicity, should be the lowest concentration at which minimal precipitate is visible in cultures, provided there is no interference with scoring. Evaluation of precipitation can be done by naked eye or by methods such as light microscopy, noting precipitate that persists or appears during culture (by the end of treatment).

Cytotoxicity
For in vitro cytogenetic assays for metaphase chromosome aberrations or for micronuclei, cytotoxicity should not exceed a reduction of about 50% in cell growth (Notes 9 and 10). For the MLA, at the top dose there should be 80-90% cytotoxicity as measured by an RTG between 20-10% (Note 9).

3.3.2 Study Design/Test Protocols
For the cytogenetic evaluation of chromosomal damage in metaphase cells in vitro, the test protocol should include the conduct of tests with and without metabolic activation, with appropriate positive and negative controls. Treatment with the test articles should be for 3 to 6 hours with a sampling time approximately 1.5 normal cell cycles from the beginning of the treatment. A continuous treatment without metabolic activation up to the sampling time of approximately 1.5 normal cell cycles should be conducted in case of negative or equivocal results for both short treatments, with and without metabolic activation. The same principles apply to the in vitro micronucleus assay, except that the sampling time is typically 1.5 to 2 normal cell cycles from the beginning of treatment to allow cells to complete mitosis and enter the next interphase. For both in vitro cytogenetic assays, there might be a need to modify the protocol for certain types of chemicals that could be more readily detected by longer treatment, delayed sampling times or recovery periods, e.g., some nucleoside analogues and some nitrosamines. In the metaphase aberration assay, information on the ploidy status should be obtained by recording the incidence of polyploid (including endoreduplicated) metaphases as a percentage of the number of metaphase cells. For MLA, the test protocol should include the conduct of tests with and without metabolic activation, with appropriate positive and negative controls, where the treatment with the test article is for 3 to 4 hours. A continuous treatment without metabolic activation for approximately 24 hours should be conducted in case of a negative or equivocal result for both short treatments, with and without metabolic activation. A standard MLA should include (i) the incorporation of positive controls that induce mainly small colonies, and (ii) colony sizing for positive controls, solvent controls and at least one positive test compound concentration (should any exist), including the culture that gave the greatest mutant frequency.
For mammalian cell assays in vitro, built-in confirmatory elements, such as those outlined above (e.g., different treatment lengths, tests with and without metabolic activation), should be used. Following such testing, further confirmatory testing in the case of clearly negative or positive test results is not usually warranted. Equivocal or weak positive results might call for repeating tests, possibly with a modified protocol such as appropriate spacing of the test concentrations.

3.3.3 Positive Controls
Concurrent positive controls are important, but in vitro mammalian cell tests for genetic toxicity are sufficiently standardized that use of positive controls can generally be confined to a positive control with metabolic activation (when it is done concurrently with the non-activated test) to demonstrate the activity of the metabolic activation system and the responsiveness of the test system.

4.1 染色体損傷の検出のためのin vivo 試験

In vivo での骨髄細胞における染色体異常の分析、又は小核を有する多染性赤血球の解析は、いずれも染色体異常誘発物質の検出に関して適切と見なされる。骨髄細胞の小核試験に使用する動物種としてラット及びマウスはともに適切であると考えられる。小核はまた、マウス末梢血の幼若赤血球（多染性赤血球）又はラット末梢血の新生網赤血球を用いてもよい（注3 参照）。同様に、他の動物種の幼若赤血球でも、骨髄又は末梢血における染色体異常誘発物質／数的異常誘発物質を検出する試験として適切な感度が示されており使用できる（注3 参照）。適切に評価されたものであれば、自動解析装置（画像解析及びフローサイトメトリー）を使用することができる（OECD、1997；Hayashi ら、2000、2007）。染色体異常は、被験物質を投与されたげっ歯類から採取培養された末梢リンパ球においても分析が可能である（注11 参照）。

4.1 Tests for the Detection of Chromosome Damage In Vivo
Either the analysis of chromosomal aberrations or the measurement of micronucleated polychromatic erythrocytes in bone marrow cells in vivo is considered appropriate for the detection of clastogens. Both rats and mice are considered appropriate for use in the bone marrow micronucleus test. Micronuclei can also be measured in immature (e.g., polychromatic) erythrocytes in peripheral blood in the mouse, or in the newly formed reticulocytes in rat blood (Note 3). Likewise, immature erythrocytes can be used from any other species which has shown an adequate sensitivity to detect clastogens/aneuploidy inducers in bone marrow or peripheral blood (Note 3). Systems for automated analysis (image analysis and flow cytometry) can be used if appropriately validated (OECD, 1997; Hayashi et al., 2000; 2007). Chromosomal aberrations can also be analyzed in peripheral lymphocytes cultured from treated rodents (Note 11).

4.2 その他のin vivo 遺伝毒性試験

標準的組合せ2（オプション2）において第2 の試験として示したin vivo 試験は、in vitro 及びin vivo 試験結果の評価におけるWOE を高めるための追加試験としても使用できる（注11 及び12 参照）。In vitro で観察された特定の反応や、作用機序に関する情報はin vivo 試験を選択する指針となり得るが、染色体異常又は内在性遺伝子における遺伝子突然変異の試験は、大部分の組織においては標準的な方法としては妥当ではない。突然変異はげっ歯類における導入遺伝子によっても検出できるが、特に細胞分裂の頻度が低い組織（注12 参照）においては突然変異の発現、固定及び蓄積を必要とするため、長期（例えば28 日間）の投与が必要となる。したがって、第2 のin vivo 試験では多くの場合、代替指標としてDNA 傷害性を評価することになる。これまでに発表された多くの文献や、推奨されるプロトコールを考慮すると、DNA 鎖切断を検出する試験である単細胞ゲル電気泳動（「コメット」）試験及びアルカリ溶出試験が推奨され、これにin vivoトランスジェニックマウス突然変異試験及びDNA 共有結合試験（これらの試験は多くの組織に適用できる、注12 参照）が加わる。さらには肝細胞を用いる不定期DNA 合成（UDS）試験も利用可能である。

4.2 Other In Vivo Genotoxicity Tests
The same in vivo tests described as the second test in the standard battery (Option 2) can be used as follow-up tests to develop weight of evidence in assessing results of in vitro or in vivo assays (Notes 11 and 12). While the type of effect seen in vitro and any knowledge of the mechanism can help guide the choice of in vivo assay, investigation of chromosomal aberrations or of gene mutations in endogenous genes is not feasible with standard methods in most tissues. Although mutation can be measured in transgenes in rodents, this entails prolonged treatment (e.g., 28 days) to allow for mutation expression, fixation and accumulation, especially in tissues with little cell division (Note 12). Thus the second in vivo assay will often evaluate a DNA damage endpoint as a surrogate. Assays with the most published experience and advice on protocols include the DNA strand break assays such as the single cell gel electrophoresis (“Comet”) assay and alkaline elution assay, the in vivo transgenic mouse mutation assays and DNA covalent binding assays, (all of which may be applied in many tissues, Note 12), and the liver unscheduled DNA synthesis (UDS) assay.

4.3 In vivo 遺伝毒性試験における用量設定
通常3 用量を解析する（Hayashi ら、2005）。

4.3.1 短期投与試験
短期投与試験（一般に1～3 回投与）では、遺伝毒性試験で推奨される最高用量は限界用量の2000 mg/kg 又は最大耐量とする。最大耐量とは（例えば小核試験[OECD]）、同様の投与方法で、より高用量を投与すると死亡が予測されるような用量として定義される。コメット試験（Hartmann ら、2003）及びトランスジェニック突然変異試験（Heddle ら、2000）についても同様な限界用量設定が推奨される。
用量設定には骨髄赤血球の増殖抑制も考慮に入れるべきである。低用量側の用量は、最高用量から通常公比約2～3 の間隔で設定する。

4.3.2 反復投与試験
オプション1 の組合せ
In vivo 遺伝毒性試験を反復投与毒性試験に組み込む場合、反復投与毒性試験の用量が臨床試験の実施を担保するための基準を満たしていれば、通常その用量は適切と判断される。その場合、その用量設定がin vivo 小核試験のOECD ガイドラインの基準と異なっていてもよい。以上の基準は、in vitro のほ乳類細胞試験が陰性（あるいは“妥当性のない陽性”、5 項参照）である場合に適用される。
追加試験又はオプション2 の組合せ
遺伝毒性兆候への追加試験を実施する場合又はin vitro のほ乳類細胞試験を行わないオプション2 を使用する場合には、その試験における最高用量が遺伝毒性の評価に適切か否かを判断するために評価すべき条件がある。下記に示した基準のうち、いずれか1 つでも満たすのであれば、小核の評価及びその他の遺伝毒性評価を行う試験（通常はラット）の最高用量として適切であると考えられる。

i. 溶媒中の医薬品の物理化学的特性に基づく投与可能最大量（MFD）（短期投与試験と同じ溶媒を使用した場合）（注13 参照）。
ii. 14 日間以上の試験では、耐量の場合には1000 mg/kg を限界用量とする。
iii. 曝露がプラトー／飽和に達する場合、あるいは化合物の蓄積が認められる場合は最大可能曝露量。逆に、親化合物の曝露が経時的に大幅に減少（例えば、初期曝露量から50％以上減少）する場合は、通常試験は不適切と考えられる（投与開始数日後に採血された血液試料を除く。）。このような現象が片方の性のみにみられる場合、代謝物の高曝露がみられない限り、曝露減少がみられる性を試験終了時に評価対象とすべきでない。
iv. 短期投与のデータがある場合、その最高用量（最小致死量付近）の50％以上の用量（短期投与による小核試験の最高用量に関してはOECD ガイドラインではその上の用量では死亡が予測される用量と記述されている；他のin vivo 試験についても同様のガイダンスがある。［例えばHartmann ら、2003］）。

毒性を伴わない曝露マージン（臨床曝露の複数倍）のみに基づく用量選択は、十分な正当性があるとは考えられない。

4.3.3 血液又は骨髄毒性のある化合物
紡錘体阻害剤のような異数性を誘発する多くの化合物は、骨髄あるいは血液を用いる小核試験において、その作用は、毒性用量に近い狭い用量範囲のみで検出される。この現象は、他の染色体異常誘発物質についても同様である。赤血球系の細胞に強い毒性（例えば、顕著な多染性赤血球（PCE）又は網赤血球の低下）を示す場合には、用量段階は、細胞毒性を示す最高用量以下、約2 倍を超えない間隔で設定すべきである。適切な用量が反復投与試験に含まれていなければ、異数性誘発物質及び細胞毒性が強い染色体異常誘発物質を検出するための追加試験として下記のものが考えられる。

i. 投与期間の増加に関連した毒性が顕著に増加した場合は、投与期間初期（投与3～4 日）の血液採取が推奨される。例えば、反復投与試験（例えば28 日間）で血液若しくは骨髄が小核の評価に使用される場合又は網赤血球を評価する場合は、重篤な血液毒性が小核の検出力に影響を及ぼす可能性がある。すなわち、短期投与で十分に小核を誘発する投与量は、反復投与においては毒性が強く発現しすぎる可能性がある（Hamada ら、2001）。
このような場合、投与初期のサンプルは、染色体異常誘発物質又は潜在的異数性誘発物質の検出について確証データを提供することができる（注14、15 参照）。
ii. In vitro のほ乳類細胞を用いる小核試験
iii. 短期投与による骨髄を用いる小核試験

4.3 Dose Selection for In Vivo Assays
Typically three dose levels are analyzed (Hayashi et al., 2005).

4.3.1 Short-Term Studies
For short-term (usually 1 to 3 administrations) studies, the top dose recommended for genotoxicity assays is a limit dose of 2000 mg/kg, if this is tolerated, or a maximum tolerated dose defined (for example for the micronucleus assay (OECD)) as the dose producing signs of toxicity such that higher dose levels, based on the same dosing regimen, would be expected to produce lethality. Similar recommendations have been made for the Comet assay (Hartmann et al., 2003) and transgenic mutation assay (Heddle et al., 2000). Suppression of bone marrow red blood cell production should also be taken into account in dose selection. Lower doses are generally spaced at approximately two to three fold intervals below this.

4.3.2 Multiple Administration Studies
Option 1 Battery
When the in vivo genotoxicity test is integrated into a multiple administration toxicology study, the doses are generally considered appropriate when the toxicology study meets the criteria for an adequate study to support human clinical trials; this can differ from dose selection criteria in the OECD guideline for the in vivo micronucleus assay. This applies when the in vitro mammalian cell test is negative (or “non-relevant positive”; see Section 5).
Follow-up studies or Option 2 Battery
When carrying out follow-up studies to address any indication of genotoxicity, or when using Option 2 with no in vitro mammalian cell assay, several factors should be evaluated to determine whether the top dose is appropriate for genotoxicity evaluation. Any one of the criteria listed below is considered sufficient to demonstrate that the top dose in a toxicology study (typically in rats) is appropriate for micronucleus analysis and for other genotoxicity evaluation:

i. Maximum Feasible Dose (MFD) based on physico-chemical properties of the drug in the vehicle (provided the MFD in that vehicle is similar to that achievable with acute administration; Note 13).
ii. Limit dose of 1000 mg/kg for studies of 14 days or longer, if this is tolerated.
iii. Maximal possible exposure demonstrated either by reaching a plateau/saturation in exposure or by compound accumulation. In contrast, substantial reduction in exposure to parent drug with time (e.g., ≥ 50% reduction from initial exposure) can disqualify the study (unless a blood sample taken in the first few days is available). If this is seen in one sex, generally the sex with reduced exposure would not be scored at the end of the study, unless there is enhanced exposure to a metabolite of interest.
iv. Top dose is ≥ 50% of the top dose that would be used for acute administration, i.e., close to the minimum lethal dose, if such acute data are available for other reasons. (The top dose for acute administration micronucleus tests is currently described in OECD guidance as the dose above which lethality would be expected; similar guidance is given (e.g., Hartmann et al., 2003) for other in vivo assays.)

Selection of a top dose based only on an exposure margin (multiple over clinical exposure) without toxicity is not considered sufficient justification.

4.3.3 Testing Compounds that are Toxic for Blood or Bone Marrow
Many compounds that induce aneuploidy, such as potent spindle poisons, are detectable in in vivo micronucleus assays in bone marrow or blood only within a narrow range of doses approaching toxic doses. This is also true for some clastogens. If toxicological data indicate severe toxicity to the red blood cell lineage (e.g., marked suppression of Polychromatic Erythrocytes (PCEs) or reticulocytes), doses scored should be spaced not more than about 2 fold below the top, cytotoxic dose. If suitable doses are not included in a multi-week study, additional data that could contribute to the detection of aneugens and some toxic clastogens could be derived from any one of the following:
i. Early blood sampling (at 3-4 days) is advisable when there are marked increases in toxicity with increasing treatment time. For example, when blood or bone marrow is used for micronucleus measurement in a multiweek study (e.g., 28 days), and reticulocytes are scored, marked hematotoxicity can affect the ability to detect micronuclei; i.e., a dose that induces detectable increases in micronuclei after acute treatment might be too toxic to analyze after multiple treatments (Hamada et al., 2001). The early sample can be used to provide assurance that clastogens and potential aneugens are detected (but see Notes 14 and 15).
ii. An in vitro mammalian cell micronucleus assay.
iii. An acute bone marrow micronucleus assay.

4.4 In vivo 試験結果が陰性の場合の標的組織での曝露証明
In vivo 試験は遺伝毒性を評価する上で重要な役割を担っている。In vivo 試験において、標的組織への被験物質の適切な曝露証明が試験結果の意義を左右する。特に、in vitro 試験で明白な遺伝毒性が認められたがin vivo 試験で陰性の場合又はin vitro ほ乳類細胞を用いる試験を実施されていない場合は標的組織の曝露証明が重要である。以下の項で示すように、曝露証明の方法として、標的組織における毒性又はトキシコキネティクスデータがある。

4.4.1 In vitro 遺伝毒性試験が陽性の場合（又は実施されていない場合）
In vivo の曝露評価は、遺伝毒性試験と同じ動物種、系統及び投与経路を用いて、最高用量又は適切な用量で行われるべきである。遺伝毒性が一般毒性試験に組み込まれて評価される場合には、曝露の情報は毒性学的評価と共有できる。
In vivo の曝露証明は次のいずれかによって行われる。

i. 細胞毒性
a. 細胞遺伝学的試験：小核試験では、試験で使用した用量及び採取時間で評価した組織（骨髄あるいは血液）における全赤血球に対する幼若赤血球の割合の有意な変化。染色体異常試験では、分裂指数の有意な減少

b. 他のin vivo 遺伝毒性試験：肝臓あるいは評価した組織における毒性。例えば、病理組織学的評価又は血液生化学的毒性指標など

ii. 曝露
a. 被験物質又はその関連物質の血中又は血漿中濃度の測定。骨髄は血液がよく灌流する組織であり、被験物質又はその関連物質の血中又は血漿中濃度は、骨髄濃度と通常同等である。また肝臓は、投与経路に関係なく全身曝露によって曝露されると予想される。
b. 標的組織における被験物質若しくはその関連物質濃度の直接測定又はオートラジオグラフィーによる組織曝露評価
全身曝露が、予測される臨床曝露と同等あるいは低い場合には以下の方法が求められる。
i. 異なる投与経路の利用
ii. より高い曝露が得られる異なる動物種の利用
iii. 異なる組織又は試験法の利用（2.3.4 項「In vivo 試験系の利用の限界」参照）
被験物質に適切に曝露されていない場合（例えば標的組織への取り込みが非常に低い場合）には、通常のin vivo 遺伝毒性試験はほとんど意味をなさないものと考えられる。

4.4.2 In vitro 遺伝毒性試験が陰性の場合
In vitro 試験で遺伝毒性が認められなかった場合、上記の方法を用いてin vivo（全身）の曝露を評価する。また、他の目的で実施されたげっ歯類における標準的な吸収、分布、代謝、排泄（ADME）試験の結果から評価してもよい。

4.4 Demonstration of Target Tissue Exposure for Negative In Vivo Test Results
In vivo tests have an important role in genotoxicity test strategies. The value of in vivo results is directly related to the demonstration of adequate exposure of the target tissue to the test compound. This is especially true for negative in vivo test results when in vitro test(s) have shown convincing evidence of genotoxicity, or when no in vitro mammalian cell assay is used. Evidence of adequate exposure could include toxicity in the tissue in question, or toxicokinetic data as described in the following section.

4.4.1 When an In Vitro Genotoxicity Test is Positive (or not done)
Assessments of in vivo exposure should be made at the top dose or other relevant doses using the same species, strain and dosing route used in the genotoxicity assay. When genotoxicity is measured in toxicology assays, exposure information is generally available as part of the toxicology assessment.
Demonstration of in vivo exposure should be made by any of the following measurements:
i. Cytotoxicity:
a. For cytogenetic assays: By obtaining a significant change in the proportion of immature erythrocytes among total erythrocytes in the tissue used (bone marrow or blood) at the doses and sampling times used in the micronucleus test or by measuring a significant reduction in mitotic index for the chromosomal aberration assay.
b. For other in vivo genotoxicity assays: Toxicity in the liver or tissue being assessed, e.g., by histopathological evaluation or blood biochemistry toxicity indicators.

ii. Exposure:
a. Measurement of drug related material either in blood or plasma. The bone marrow is a well perfused tissue and levels of drug related materials in blood or plasma are generally similar to those observed in bone marrow. The liver is expected to be exposed for drugs with systemic exposure regardless of the route of administration.
b. Direct measurement of drug-related material in target tissue, or autoradiographic assessment of tissue exposure.

If systemic exposure is similar to or lower than expected clinical exposure, alternative strategies might be called for such as:
i. Use of a different route of administration;
ii. Use of a different species with higher exposure;
iii. Use of a different tissue or assay (see Section 2.3.4, “Limitations to the use of standard in vivo tests”).
When adequate exposure cannot be achieved (e.g., with compounds showing very poor target tissue availability) conventional in vivo genotoxicity tests have little value.

4.4.2 When In Vitro Genotoxicity Tests are Negative
If in vitro tests do not show genotoxic potential, in vivo (systemic) exposure can be assessed by any of the methods above, or can be assumed from the results of standard Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion (ADME) studies in rodents done for other purposes.

4.5 In vivo 試験における採取時間
In vivo 小核試験、染色体異常試験及びUDS 試験における採取時間は、OECD ガイドライン（1997）に従うべきである。
小核試験が反復投与試験に組み込まれる場合には、血液あるいは骨髄の採取は最終投与の翌日に行う（上述の追加血液採取の推奨を参照）。
その他の遺伝毒性試験では、採取時間は試験に合わせて選択する；例えばDNA 損傷/DNA 鎖切断の判定は、通常最終投与後数時間（例えば2～6 時間）に行われる。単回投与する場合は、投与後数時間と投与後24 時間の2 ポイントで採取する。
原則として、最高用量又は曝露が適切であれば、どのような投与期間の試験でも受け入れられる。

4.5 Sampling Times for In Vivo Assays
Selection of the sampling time in the in vivo Micronucleus (MN), chromosomal aberration and UDS test should follow OECD (1997).
When micronucleus analysis is integrated into multi-week studies, sampling of blood or bone marrow can be done the day after the final administration (see recommendation for additional blood sampling time above).
For other genotoxicity assays, sampling time should be selected as appropriate for the endpoint measured; for example, DNA damage/strand break measurements are usually made a few (e.g., 2-6) hours after the last administration for the multiple daily administration. In the case of single administration, two sampling times should be used: a few hours and 24 hours after the treatment.
In principle, studies of any length can be considered appropriate, provided the top dose/exposure is adequate.

4.6 観察動物数
観察動物数は、小核試験（OECD）又は他の遺伝毒性試験で現在推奨されている動物数を設定する。一般的にはすべての投与動物を観察する必要はない。遺伝毒性評価用の動物は毒性試験に用いた動物から無作為に抽出されるべきである。

4.6 Number of Animals Analyzed
The number of animals analyzed is determined by current recommendations for the micronucleus assay (OECD) or other genotoxicity assays and generally does not include all the animals treated for a toxicology study. Animals used for genotoxicity analyses should be randomly selected from the group used for the toxicology study.

4.7 In vivo 遺伝毒性試験におけるげっ歯類の性の選択
男性又は女性にのみに用いられる医薬品の試験を行う場合には、適切な性を用いて試験を実施する。短期投与のin vivo 試験では、一般的には片側の性のみで実施する。短期投与試験で両性の使用が考慮されるのは、使用する動物種で、毒性、代謝又は曝露（Cmax 又はAUC）において毒性学的に意味のある性差が示されている場合のみである。その他の場合は、雄のみの使用が適切である。遺伝毒性試験を雌雄動物の反復投与毒性試験に組み入れる場合には、標本は両性から採取するが、毒性又は代謝において性差を示す十分な根拠がなければ、片側の性の観察のみでよい。投与量は「適切な投与量の基準（4.3.2 及び4.3.3 項）」に従う。
その他のin vivo 遺伝毒性試験についても同じ原則が適用される。

4.7 Use of Male/Female Rodents in In Vivo Genotoxicity Tests
If sex-specific drugs are to be tested, then the assay can be done in the appropriate sex. In vivo tests with the acute protocol can generally be carried out in only one sex. For acute tests, both sexes should be considered only if any existing toxicity, metabolism or exposure (Cmax or AUC) data indicate a toxicologically meaningful sex difference in the species being used. Otherwise, the use of males alone is considered appropriate for acute genotoxicity tests. When the genotoxicity test is integrated into a repeat-dose toxicology study in two sexes, samples can be collected from both sexes, but a single sex can be scored if there is no substantial sex difference evident in toxicity/metabolism. The dose levels for the sex(es) scored should meet the criteria for appropriate dose levels (see Sections 4.3.2 and 4.3.3).
Similar principles can be applied for other established in vivo genotoxicity tests.

4.8 投与経路
投与経路は通常、経口、静脈内又は皮下などの予定臨床投与経路とするが、局所用剤のような場合には全身曝露を得るために、投与経路を変更してもよい（2.3.4 項参照）。

4.8 Route of Administration
The route of administration is generally the expected clinical route, e.g., oral, intravenous or subcutaneous, but can be modified if appropriate in order to obtain systemic exposure, e.g., for topically applied compounds (see Section 2.3.4).

4.9 In vivo 試験の陽性対照の使用
In vivo 試験では、試験施設が試験を行うのに十分な能力がある場合には、定期的に陽性対照物質の動物に対する反応が確認されていれば、試験ごとに同時陽性対照群を置く必要はないと考えられる（注16 参照）。

4.9 Use of Positive Controls for In Vivo Studies
For in vivo studies, it is considered sufficient to treat animals with a positive control only periodically, and not concurrently with every assay, after a laboratory has established competence in the use of the assay (Note 16).

In vitro 試験系では、げっ歯類のがん原性予測に対して偽陰性及び偽陽性の結果を与えることが試験結果の比較から明らかにされている。遺伝毒性試験の組合せ（in vitro 及び in vivo 試験）は、大部分の既知ヒト発がん物質でみられるように、直接的に遺伝的傷害を引き起こし作用すると考えられている発がん物質を検出する。したがって、これらの試験の組合せでは非遺伝毒性発がん物質は検出できない。In vitro の代謝活性化系に限界があるように、試験条件によってはin vitro 試験は偽陰性の結果をもたらすことがある。組合せ試験は、遺伝毒性を示す化合物が偽陰性となる危険性を減少させるようにデザインされているが、ある試験で陽性となった化合物が必ずしもヒトに対して遺伝毒性／発がん性を持つことを意味するものではない。
陽性のin vitro データは、医薬品が化学物質の特性として遺伝毒性を持つことを示しているが、多くの場合、これらin vitro の陽性結果の生物学的意義は適切なin vivo 試験で検証される必要がある。さらに、ある濃度以上でのみ作用を現す間接的遺伝毒性の機序が知られており、このような作用機序を持つ医薬品については、安全レベル（閾値）を設定することが可能であるとされている（5.2 項、Müller とKasper、2000；Scott ら、1991；Thybaud ら、2007）。

Comparative trials have shown conclusively that each in vitro test system generates both false negative and false positive results in relation to predicting rodent carcinogenicity. Genotoxicity test batteries (of in vitro and in vivo tests) detect carcinogens that are thought to act primarily via a mechanism involving direct genetic damage, such as the majority of known human carcinogens. Therefore, these batteries are not expected to detect non-genotoxic carcinogens. Experimental conditions, such as the limited capability of the in vitro metabolic activation systems, can lead to false negative results in in vitro tests. The test battery approach is designed to reduce the risk of false negative results for compounds with genotoxic potential. On the other hand a positive result in any assay for genotoxicity does not always mean that the test compound poses a genotoxic/carcinogenic hazard to humans.
Although positive in vitro data could indicate intrinsic genotoxic properties of a drug, appropriate in vivo data determine the biological significance of these in vitro signals in most cases. Also, because there are several indirect mechanisms of genotoxicity that operate only above certain concentrations, it is possible to establish a safe level (threshold) for classes of drugs with evidence for such mechanisms (see 5.2. below, Müller and Kasper, 2000; Scott et al., 1991; Thybaud et al., 2007).

5.1 生物学的妥当性の評価
試験が適切な用量間隔、適切な毒性レベルで実施された場合、以下のように考えることができる。
In vitro あるいはin vivo で、遺伝毒性の明らかな増加が認められるが、その程度が弱い場合はまずその再現性及び生物学的な意義について評価すべきである。生物学的に意味が乏しいと判断される例を以下に示す。
i. 陰性又は溶媒対照の値と比較して統計学的に有意であるが、試験施設での適切な背景データの統計信頼区間の範囲内にある軽度の増加
ii. 再現性のない弱い反応／不確かな反応
上記のいずれかの条件があてはまり、WOE から遺伝毒性がないと考えられれば、陰性又は生物学的に妥当性がない所見と判断され、追加試験の必要はない。

5.1 Assessment of Biological Relevance
The recommendations below assume that the test has been conducted using appropriate spacing of doses, levels of toxicity etc.
Small increases in apparent genotoxicity in vitro or in vivo should first be assessed for reproducibility and biological significance. Examples of results that are not considered biologically meaningful include:
i. Small increases that are statistically significant compared with the negative or solvent control values but are within the confidence intervals of the appropriate historical control values for the testing facility.
ii. Weak/equivocal responses that are not reproducible.
If either of the above conditions applies, the weight of evidence indicates a lack of genotoxic potential, the test is considered negative or the findings not biologically relevant, and no further testing is called for.

5.2 In vitro 試験結果の評価
特に細菌を用いる変異原性試験では、陽性結果が不純物に起因していないかを判断するため、被験物質の純度を考慮すべきである。

5.2.1 細菌を用いる復帰突然変異試験で得られた陽性結果の評価
エームス試験で得られた陽性結果は、DNA との反応性があることを示しているため、適切なリスク－ベネフィット解析により担保されない限り、in vivo での変異原性又は発がん性を評価するための広範囲の追加試験が、患者に投与する際の予測される潜在的リスクを評価するために必要である。変異体ではない疑似的なコロニー増加の例が知られている。これらはアミノ酸の混入によって引き起こされる（ネズミチフス菌の試験系ではヒスチジン、大腸菌の試験系ではトリプトファン）。そのため、細菌を用いる復帰突然変異試験は分解しやすいペプチドの試験には適さない。また、例えば細菌のニトロ還元酵素による活性化のように、細菌の特異的な代謝が関与する陽性反応も存在し、ヒトでの遺伝毒性とは無関係の場合もある。

5.2.2 ほ乳類細胞を用いる試験で得られた陽性結果の評価
陽性結果が得られた場合のWOE による評価及び追加試験の推奨に関してはIWGT の報告書の中で議論されている（例えばThybaud ら、2007 ）。さらに、論文などでin vitro 試験での陽性結果の妥当性を疑わせるようないくつかの条件についても報告されている。したがって、いかなるin vitro 試験での陽性結果についても、以下に示すようなWOE を考慮して評価されるべきである。以下の項目はすべてを網羅したものではないが、判定を下すための一助となろう。
i. In vivo では起こりえない条件（pH；浸透圧；析出物）
1 mMまでは浸透圧の増加を考慮する必要はない。また、被験物質がpH を変化させる場合は、被験物質処理時のpH を無処理群の正常pH に調整することが推奨される。
ii. 強い毒性が発現する濃度のみでの作用
MLA においてRTG が80％以上低下した場合
In vitro 細胞遺伝学的試験において細胞増殖が50％以上抑制された場合
上記の条件があてはまり、WOE から遺伝毒性の可能性がないと判断できれば、標準的組合せ（オプション１）に従う。このような場合には、1 つのin vivo 試験の実施で十分であると考えられる。

5.2.3 In vitro の陰性結果の評価
In vitro 試験で陰性でも、次のような場合には追加試験を考慮すべきである（ここにあげた例はすべてを網羅したものではないが、判断を下すための一助となろう。）：化合物の構造やその既知の代謝経路から考えて、標準的なin vitro 代謝活性化法（例えば、げっ歯類肝S9）が不適切と考えられる場合。化合物の構造や既知の活性から考えて、他の方法／試験系が適切と考えられる場合。

5.2 Evaluation of Results Obtained in In Vitro Tests
In evaluating positive results, especially for the microbial mutagenicity test, the purity of the test compound should be considered, to determine whether the positive result could be attributable to a contaminant.

5.2.1 Evaluation of Positive Results Obtained In Vitro in a Bacterial Mutation Assay
Since positive results in the Ames test are thought to indicate DNA reactivity, extensive follow-up testing to assess the in vivo mutagenic and carcinogenic potential would be warranted to assess the potential risk for treatment of patients, unless justified by appropriate risk-benefit analysis.
There are some well characterized examples of artifactual increases in colonies that are not truly revertants. These can occur due to contamination with amino acids (i.e., providing histidine for Salmonella typhimurium strains or tryptophan for Escherichia coli strains), so that the bacterial reversion assay is not suitable for testing a peptide that is likely to degrade. Certain cases exist where positive results in bacterial mutation assays might be shown not to indicate genotoxic potential in vivo in humans, for example when bacterial-specific metabolism occurs, such as activation by bacterial nitroreductases.

5.2.2 Evaluation of Positive Results Obtained In Vitro in Mammalian Cell Assays
Recommendations for assessing weight of evidence and follow-up testing for positive genotoxicity results are discussed in IWGT reports (e.g., Thybaud et al., 2007). In addition, the scientific literature gives a number of conditions that can lead to a positive in vitro result of questionable relevance. Therefore, any in vitro positive test result should be evaluated based on an assessment of the weight of evidence as indicated below. This list is not exhaustive, but is given as an aid to decision-making.
i. The conditions do not occur in vivo (pH; osmolality; precipitates).
(Note that the 1 mM limit avoids increases in osmolality, and that if the test compound alters pH it is advisable to adjust pH to the normal pH of untreated cultures at the time of treatment).
ii. The effect occurs only at the most toxic concentrations.
In the MLA increases at ≥80% reduction in RTG.
For in vitro cytogenetics assays when growth is suppressed by ≥50%.
If any of the above conditions apply the weight of evidence indicates a lack of genotoxic potential; the standard battery (Option 1) can be followed. Thus, a single in vivo test is considered sufficient.

5.2.3 Evaluation of In Vitro Negative Results
For in vitro negative results further testing should be considered in special cases, such as (the examples given are not exhaustive, but are given as an aid to decision-making): The structure or known metabolism of the compound indicates that standard techniques for in vitro metabolic activation (e.g., rodent liver S9) might be inadequate; the structure or known activity of the compound indicates that the use of other test methods/systems might be appropriate.

5.3 In vivo 試験で得られた結果の評価
In vivo 試験には、吸収、分布及び排泄というin vitro 試験にはない要素が勘案されているという特徴があり、したがって、ヒトへの適用に重要な意味を持つ。さらに、薬物代謝はin vitro で通常使用されている系と比べると、in vivo の系の方がより生物学的に妥当性がある。In vivo とin vitro の結果が一致しない場合には両者の相違についてケース・バイ・ケースで判断され、説明がなされるべきである（例えば、代謝の差、in vivo での効率的な排泄など）。
In vivo 試験においても偽陽性（misleading positive）結果を引き起こす可能性がある。例えば、
i. 遺伝毒性物質の投与がない場合でも小核の増加がみられることがあり、これは造血障害によることが知られている（Tweats ら、2007, I）。
ii. DNA 付加体のデータは、既知の内因性付加体の背景レベルを考慮に入れて解釈すべきである。
iii. 毒性に関連した間接的な作用が、DNA 鎖切断の結果に影響を及ぼすことがある（例えば、アルカリ溶出試験及びコメット試験において）。
このように、遺伝毒性データを評価する際にはすべての毒性学的及び血液学的所見を考慮することが重要である（注15 参照）。毒性学的変化に関連する間接的な作用には安全域があり、これらが臨床で発現するとは考えにくい。

5.3 Evaluation of Results Obtained from In Vivo Tests
In vivo tests have the advantage of taking into account absorption, distribution and excretion, which are not factors in in vitro tests, but are potentially relevant to human use. In addition metabolism is likely to be more relevant in vivo compared to the systems normally used in vitro. If the in vivo and in vitro results do not agree, then the difference should be considered/explained on a case-by-case basis, e.g., a difference in metabolism; rapid and efficient excretion of a compound in vivo.
In vivo genotoxicity tests also have the potential to give misleading positive results that do not indicate true genotoxicity. As examples:
i. Increases in micronuclei can occur without administration of any genotoxic agent, due to disturbance in erythropoiesis (Tweats et al., 2007, I).
ii. DNA adduct data should be interpreted in the light of the known background level of endogenous adducts.
iii. Indirect, toxicity-related effects could influence the results of the DNA strand break assays (e.g., alkaline elution and Comet assays).
Thus it is important to take into account all the toxicological and hematological findings when evaluating the genotoxicity data (Note 15). Indirect effects related to toxicological changes could have a safety margin and might not be clinically relevant.

5.4 陽性結果に対する追加検討
5.4.1 ほ乳類細胞を用いるin vitro 試験結果に対する追加検討
以下の論議は細菌を用いる復帰突然変異試験は陰性であることを前提としてなされている。

5.4.1.1 作用機序／in vivo の追加検討
ほ乳類細胞を用いるin vitro 試験での陽性結果に妥当性がないことを示すWOE が不十分である場合、追加のin vitro 試験（下記i）又は2 種類の適切なin vivo 試験を実施することを推奨する（下記ii）。これらは、ほ乳類細胞試験陽性に対して推奨される追加検討として実験的根拠を与えるものとなるであろう。
i. 陽性結果が妥当性を欠くものであることを示す作用機序に関する情報は、しばしばin vitro から得られる。例えば、染色体異常を誘発したり、またMLA で陽性を示したりしてもDNA 損傷性がない化合物であるとする証拠もある（例：エームス試験に加え、他の突然変異／DNA 傷害試験で陰性；化学構造に関する考察）。また、in vivo では妥当とされない又は閾値が想定される間接的な作用機序の証拠（例：DNA 合成阻害、高濃度のみで産生される活性酸素種）があげられる（Galloway ら、1998；Scott ら、1991；MullerとKasper、 2000）。同様のケースは、in vitro 小核試験における陽性結果の追加検討についても言える。染色体の損失又は異数性の機序が考えられ、染色体の損失を示す動原体染色実験（注17 参照）が証拠としてあげられる。倍数性はin vitro の染色体異常試験ではよくみられる所見である。異数性誘発物質は倍数性を誘発するが、倍数性だけでは異数性誘発の証拠としては不十分である。単に細胞周期の遅延によるのかもしれない。それは、通常、細胞毒性の増加も伴う。In vitro 試験において構造的な染色体異常はないが倍数性がみられる場合には、適切に曝露されたことが確認されたin vivo 小核試験の陰性結果により、異数性誘発能を有さないことが十分に担保される。
上記の機序に関する情報及びWOE が、陽性結果が妥当性を欠くことの裏づけとなるのであれば、適切な曝露情報を有する1 つのin vivo 試験の陰性により、遺伝毒性がないことを示すことができる。これに用いられるのは、一般に細胞遺伝学的試験であり、染色体の損失を追加検討する場合はin vivo 小核試験が推奨される。
妥当性がないと判断しうる十分なWOE がない場合、又は作用機序に関する情報がない場合には、2 種類のin vivo 試験が要求される。この場合、適切な遺伝毒性の指標及び組織（通常2 つの異なる組織）で行う。さらに、in vivo モデルで十分な曝露が得られることが重要である。
又は
ii. 曝露証明を伴い異なる組織を用いての適切なin vivo 試験を2 種類実施する。
以上を要約すると、試験が的確になされ、曝露が確認された適切なin vivo 試験の陰性結果は（4.4.1 項参照）、遺伝毒性を示さない十分な証拠となる。

5.4.1.2 S9 活性化系存在下でのin vitro 試験の陽性結果に対する追加検討
S9 活性化系の存在下のみで陽性結果がみられた場合には、代謝活性化がその要因であり、代謝活性化以外の条件（例えば、非代謝活性化系のインキュベーションにおける10％以上の血清と比較した、S9 mix 存在下での低濃度の血清又は無血清）が関与していないことを確認する。
ここでの追加試験の目的はin vitroでの結果のin vivo条件に対する妥当性を確認することであり、通常、肝臓を用いるin vivo 試験が対象となる（注18 参照）。

5.4.2 In vivo 小核試験の陽性結果に対する追加検討
In vivo で小核の増加がみられる場合には、非遺伝毒性作用が原因あるいは関与している可能性を判断するため、すべての毒性試験データを考察する（注15 参照）。造血障害あるいは生理的攪乱（低体温、高体温）のような非特異的作用が疑われる場合には、in vitro 染色体異常試験がより適切かもしれない。小核の「真の」増加が懸念される場合には、その増加が染色体の損失によるものか、又は染色体の切断に起因するかを立証する必要がある（注17 参照）。例えば紡錘体阻害剤による異数性の誘発は、非線形の用量相関反応性を示すという証拠がある。したがって、染色体の損失には閾値があり、それより低い曝露では染色体損失は生じず、臨床での曝露と比較して適切な安全域があると判断することは可能であろう。
結論として、化合物の遺伝毒性誘発能の評価は、得られた所見全体を考慮に入れ、in vitro 及びin vivo 両試験の本質的な意義及び限界を認識すべきである。

5.4 Follow-up Strategies for Positive Results
5.4.1 Follow-up to Findings in In Vitro in Mammalian Cell Tests
The following discussion assumes negative results in the Ames bacterial mutation assay.

5.4.1.1 Mechanistic/In Vivo Follow-up
When there is insufficient weight of evidence to indicate lack of relevance, recommended follow-up for positive mammalian cell assays would be to provide experimental evidence, either by additional in vitro studies (i, below) or by carrying out two appropriate in vivo assays (ii, below), as follows:
i. Mechanistic information that contributes to a weight of evidence for a lack of relevant genotoxicity is often generated in vitro, for example evidence that a test compound that induces chromosome aberrations or mutations in the MLA is not a DNA damaging agent (e.g., other negative mutation/DNA damage tests in addition to the Ames test; structural considerations), or evidence for an indirect mechanism that might not be relevant in vivo or might have a threshold (e.g., inhibition of DNA synthesis, reactive oxygen species produced only at high concentrations) (Galloway et al., 1998; Scott et al., 1991; Müller and Kasper, 2000). Similar studies can be used to follow up a positive result in the in vitro micronucleus assay, or in this case evidence can include a known mechanism that indicates chromosome loss/aneuploidy, or centromere staining experiments (Note 17) that indicate chromosome loss. Polyploidy is a common finding in chromosome aberration assays in vitro. While aneugens can induce polyploidy, polyploidy alone does not indicate aneugenic potential and can simply indicate cell cycle perturbation; it is also commonly associated with increasing cytotoxicity. If polyploidy, but no structural chromosome breakage, is seen in an in vitro assay, generally a negative in vivo micronucleus assay with assurance of appropriate exposure would provide sufficient assurance of lack of potential for aneuploidy induction.
If the above mechanistic information and weight of evidence supports the lack of relevant genotoxicity, only a single in vivo test with appropriate evidence of exposure is called for in order to establish the lack of genotoxic activity. This is typically a cytogenetic assay, and the micronucleus assay in vivo is called for when following up potential for chromosome loss.
If there is not sufficient weight of evidence or mechanistic information to rule out relevant genotoxic potential, two in vivo tests are generally called for, with appropriate endpoints and in appropriate tissues (usually two different tissues), and with an emphasis on obtaining sufficient exposure in the in vivo models.
Or
ii.
Two appropriate in vivo assays are done, usually with different tissues, and with supporting demonstration of exposure.
In summary, negative results in appropriate in vivo assays, with adequate justification for the endpoints measured and demonstration of exposure (see Section 4.4.1) are considered sufficient to demonstrate absence of significant genotoxic risk.

5.4.1.2 Follow-up to an In Vitro Positive Result That is Dependent upon S9 Activation
When positive results are seen only in the presence of the S9 activation system, it should first be verified that metabolic activation is responsible and not some other difference in conditions (e.g., low or no serum in the S9 mix, compared with ≥10% serum in the non-activated incubations). The follow-up strategy is then aimed at determining the relevance of the results in vitro to conditions in vivo, and will generally focus on in vivo studies in liver (Note 18).

5.4.2 Follow-up to a Positive In Vivo Micronucleus Assay
If there is an increase in micronuclei in vivo, all the toxicological data should be evaluated to determine whether a non-genotoxic effect could be the cause or a contributing factor (Note 15). If non-specific effects of disturbed erythropoiesis or physiology (such as hypo/hyperthermia) are suspected, an in vivo assay for chromosome aberrations might be more appropriate. If a “real” increase is suspected, strategies should be used to demonstrate whether the increase is due to chromosome loss or chromosome breakage (Note 17). There is evidence that aneuploidy induction, e.g., with spindle poisons, follows a non-linear dose response. Thus, it might be possible to determine that there is a threshold exposure below which chromosome loss is not expected and to determine whether an appropriate safety margin exists compared with clinical exposure.
In conclusion, the assessment of the genotoxic potential of a compound should take into account the totality of the findings and acknowledge the intrinsic values and limitations of both in vitro and in vivo tests.

5.5 がん原性試験で認められた腫瘍発生に関連する追加の遺伝毒性試験
標準的組合せ試験では陰性であるが、がん原性試験で腫瘍の発生頻度の増加を示し、不十分な証拠ではあるが非遺伝毒性の機序が示された化合物に関しては、適切な試験系を用いた追加試験の実施が望まれる。作用機序の理解を助けるための補助的な試験として、in vitro 試験における代謝活性化の条件の変更や、腫瘍が誘発された標的臓器における遺伝子損傷を指標とするin vivo 試験、例えばコメット試験あるいはアルカリ溶出試験のようなDNA 鎖切断試験、肝UDS試験、DNA 共有結合性（例えば、32P ポストラベル法）、導入遺伝子における突然変異誘発又は腫瘍関連遺伝子の遺伝的変異の分子レベルでの解析が含まれる（Kasper ら、2007）。

5.5 Follow-up Genotoxicity Testing in Relation to Tumor Findings in a Carcinogenicity Bioassay
Additional genotoxicity testing in appropriate models can be conducted for compounds that were negative in the standard test battery but which have shown increases in tumors in carcinogenicity bioassay(s) with insufficient evidence to establish a non-genotoxic mechanism. To help understand the mode of action, additional testing can include modified conditions for metabolic activation in in vitro tests or can include in vivo tests measuring genetic damage in target organs of tumor induction, such as DNA strand break assays (e.g., comet or alkaline elution assays), liver UDS test, DNA covalent binding (e.g., by 32P-postlabelling), mutation induction in transgenes, or molecular characterization of genetic changes in tumor-related genes (Kasper et al., 2007).

1. In vitro の小核試験は国際共同研究（Kirsch-Volders ら、2003）において幅広く評価され、ECVAM（Corvi ら、2008）によって有効性が検証され、OECD ガイドライン487（2010）として策定された。
2. 標準的組合せのin vitro 試験では陰性若しくは弱陽性又は相反する結果しか得られないが、骨髄の染色体損傷試験で明らかに陽性となる遺伝毒性発がん物質が少数ながら存在する。
プロカルバジン、ヒドロキノン、ウレタン、ベンゼンなどがこの分類に入る。企業の調査から、その他のいくつかの例がTweats ら（2007,II）によって紹介されている。
3. 原則として、造血細胞の小核は、骨髄ではいかなる動物種においても評価可能であり、また、血液では全身を循環している小核含有赤血球が脾臓で取り除かれない動物種において評価可能と考えられる。マウスの場合、血液では多染性赤血球を用いて小核の計測が可能であり、約4 週間以上の継続投与をした場合には成熟（正染性）赤血球も使用可能である。ラットの場合、小核を有する赤血球は速やかに血液中から取り除かれるが、一連の染色体異常誘発物質及び異数性誘発物質による小核の誘発がラットの網赤血球を用いて検出可能なことが確認されている（Wakata ら、1998；Hamada ら、2001）。ラットの血液は新しく生成された網赤血球を確実に観察でき（Hayashi ら、2007；MacGregor ら、2006）、骨髄よりも低い血液での小核頻度を検出できる適当な統計学的な感度を与えられるだけの十分な観察細胞数があれば、小核試験に利用できる（Kissling ら、2007）。骨髄又は血液で、自動計測又はマニュアル計測のいずれの方法を選択しても、各試験施設は動物間のばらつきを下回るレベルに測定誤差を維持できるだけの最小限の観察細胞数を決定する必要がある。
イヌ又はアカゲザルを用いた小核誘発の検討が行われており、現在利用可能となっている（Harper ら、2007；Hotchkissr ら、2008）。このような代替動物種が有用とされる一例として、げっ歯類では十分に認められないがイヌやサルでは生成されるようなヒト代謝物の評価があげられる。
4. 試験の組合せに示す2 つのオプションは同様に適切であるが、それぞれの被験物質特有の性質により、一方がより適切となる場合がある。例えば、実験動物における全身曝露が、臨床で予想される曝露と同等かそれ以下の場合には、in vitro 試験を選択すべきである：オプション1（2.3.4 及び4.4.1 参照）。一方、オプション2 は肝臓での試験も含んでおり、肝臓で短寿命の活性代謝物が生成されると予想される場合に推奨される。
5. ある種の警告部分構造を有する化学物質は、発がん性や変異原性とある程度関連があると考えられている。警告部分構造の例として、アルキル化求電子中心、不安定型エポキシド、芳香族アミン類、アゾ構造、N-ニトロソ基及び芳香族ニトロ基があげられる（AshbyとPaton、1994）。特別な警告部分構造を有するある種の化学物質では、プロトコールの特別な変更／追加による試験が遺伝毒性の検出に重要であることが明らかにされている（例えばアゾ基含有化学物質、配糖体、活性化にニトロ還元を必要とするニトロイミダゾールのような化学物質、代謝活性化に別種のげっ歯類のS9 を必要とするフェナセチンのような化学物質）。
6. 皮膚及び結腸におけるin vivo 小核試験が開発されている（Hayashi ら、2007）。また、これらの組織ではDNA 損傷試験も用いることが可能である。
7. プレート法又はプレインキュベーション法で検出感度に差のある場合があるが、量的な違いのみで、結果が逆転することはない（Gatehouse ら、1994）。両プロトコールで試験した製薬企業の経験では、2 つの試験法で異なる結果は得られておらず、また、IWGTの報告書（Gatehouse ら、1994）ではプレインキュベーション法でより容易に検出できるとされる化学物質は一般に医薬品ではなく、また、肝臓を用いるin vivo 遺伝毒性試験で陽性を示すものであった。これらには短鎖の脂肪族ニトロソアミン；二価金属；アルデヒド（例えばホルムアルデヒド、クロトンアルデヒド）；アゾ色素（例えばバターイエロー）；ピロリジジンアルカロイド；アリル化合物（イソチオシアン酸アリル、塩化アリル）及びニトロ（例えば芳香族、脂肪族）化合物が含まれる。
8. In vitro のほ乳類培養細胞試験における最大濃度を1 mMとする理論的根拠は以下のとおりである。試験の標準的組合せはエームス試験とin vivo 試験が含まれている。この標準的組合せは、個別の試験結果のみに頼らずに遺伝毒性発がん物質を検出することに最適化されている。エームス試験又はin vivo 遺伝毒性試験では検出されないが、in vitro のほ乳類細胞試験の1 mM以上でのみ検出されるような化学物質（DNA を損傷する発がん物質）が存在する可能性は低い。さらに、上限の1 mMは、既知医薬品の組織中の濃度を含めた臨床曝露より高く（Goodman とGilman、2001）、また、in vivo の非臨床試験で一般的に達する量より高いことからハザード同定の色合いが強い。ヌクレオシドアナログ及びいくつかの抗生物質のように、ある種の薬物は極めて高い臨床曝露を必要とすることが知られている。既存薬物との強さの比較は興味のあるところであり、1 mM の上限以上での評価が必要であったとしても、ヒトの安全性を最終的に決定するのはin vivo 試験である。極めて低い分子量（200 以下のような）の医薬品の場合には、より高い試験濃度を考慮すべきである。
9. ある種の遺伝毒性発がん物質は、ある程度の細胞毒性を引き起こす濃度で試験しない限り、in vitro 遺伝毒性試験では検出されないが、DNA に直接損傷を与えるような物質は一般に中等度の毒性レベルで検出可能である（Greenwood ら、2004）。細胞毒性が強くなるに従って、試験化合物又はその代謝物による直接的なDNA 損傷以外の作用により、遺伝毒性ではなく細胞毒性に関連した「陽性」結果をもたらすことがある。このような非DNA 損傷性によって、二次的におこる間接的DNA 損傷の誘発は、ある閾値濃度以上で引き起こされることが多い。このような細胞機能障害が薬理学的に妥当性のあるような低濃度で引き起こされるとは考えられない。
染色体異常誘発能の弱い既知発がん物質であっても、細胞遺伝学的試験においては、50％より低い細胞増殖抑制濃度で陽性結果を示す。一方、DNA 損傷、変異原性又はがん原性を有しない化学物質でも、細胞毒性が認められるような濃度で染色体切断を誘発することがある。In vitro 細胞遺伝学的試験（染色体異常試験及びin vitro 小核試験）において、約50％の増殖抑制を上限とすることは適切と考えられる。
株化細胞を用いた細胞遺伝学的試験では、細胞を計数するだけでは毒性を過小評価するおそれのあることが知られているため、時間経過における細胞集団増殖の測定値（培養中の細胞数の変化を対照と比較して測定する。例えば細胞集団倍加[PD；注10 参照]と呼ばれる方法）が、細胞毒性の指標として有用であることが示されている。リンパ球の培養では、約50％を超えない分裂抑制が十分と考えられる。このためには、分裂中期像の異常をみる試験の場合は分裂指数（MI）を、in vitro 小核試験では細胞分裂阻止に基づく指標を用いることができる。さらにin vitro 小核試験については、小核は細胞分裂に続く間期で計数されることから、細胞周期全体が回っているのを確認することが重要である。このためには、細胞分裂はさせないが核分裂には影響しないサイトカラシンB の使用が考えられ、二核細胞における小核を計数すればよいことになる（リンパ球を用いる場合に推奨される。）。株化細胞では、上に記した時間経過による細胞集団倍加（PD）など、細胞増殖を他の方法で証明することもできる（Kirsch-Volders ら、2003）。
MLA にはソフトアガー法及びマイクロウェル法があるが、ともに最高濃度を相対総増殖率（RTG）が20％に近い（10～20%）濃度に設定することで適切な感受性が得られる（Moore ら、2002）。公表データを現在の基準で再調査すると、RTG が20％未満の濃度でのみMLA 結果が陽性であったげっ歯類発がん物質は極めて少数であり、この範疇の化学物質については遺伝毒性発がん物質である信頼に足る証拠がない。20％以下のRTGでのみ突然変異の増加がみられる場合には結果の解釈を慎重に行う必要があり、RTG が10％以下の濃度のみで突然変異の誘発が認められる場合、陽性とは判断できない。
結論として、細胞増殖／生存細胞率の減少が、細胞遺伝学的試験では50％、MLA では80％に達するかそれ以上で得られた陽性結果の解釈には注意が必要である。このような細胞毒性／コロニー形成率（clonal survival）レベルで処理された細胞を評価することは、感度を高め、不適切な陽性結果をもたらす危険性を増加させる。遺伝毒性試験の組合せは、強い細胞毒性発現用量を用いた単一のin vitro ほ乳類細胞試験に頼らなくても、適切な感度を保証できるようデザインされている。
適切な毒性の範囲を得るため、広い範囲の濃度を用いた用量設定のための予備試験は有用であるが、遺伝毒性試験ではしばしば極めて狭い間隔（公比2 以下）で数段階の濃度を用いることが重要である。標準的な設定数以上の用量で試験が実施されることもありうるが、すべての処理濃度群について評価する必要はない。正確な50％の増殖抑制あるいは80％のRTG 抑制を示す濃度で試験するために、何度も試験を繰り返すことを意図するものではない。
10. In vitro の細胞遺伝学的試験において、細胞毒性を評価するためには、細胞の計数では細胞毒性を過小に見積もることがあるため細胞毒性評価には相対細胞増殖率が適している（Greenwood ら、2004）。50％増殖抑制レベルを算定するために細胞集団倍加（用語の解説を参照）を用いると、DNA に直接損傷を与える物質は確実に陽性となる一方で、変異原性あるいは発がん性を有さない物質の陽性頻度が減少することが示されている。
11. 骨髄の分裂中期細胞が使用されるのと同様に、被験物質を1 回以上投与された試験動物から採取して培養したリンパ球の分裂中期における染色体異常を調べることが有用な場合がある。循環しているリンパ球は複製しないため、遺伝毒性作用に複製が必要な薬剤（例えばいくつかのヌクレオシドアナログ）では、通常のリンパ球細胞を用いた場合には検出されないと考えられる。ある種のリンパ球の寿命は長いため、原理的に修復されないDNA 損傷の蓄積が起こる可能性があり、これらの細胞がin vitro で分裂を誘導された時に染色体異常が増加する可能性がある。In vivo のリンパ球試験は染色体異常誘発能を調べるための追加試験として有用となりうるが、一般には、造血細胞の小核試験に加え、肝臓のような他の組織を用いた方が、より多くの情報が得られる。すなわち薬物及び代謝物の曝露がしばしば肝臓でより高いためである。
12. 試験の組合せに第2 のin vivo 試験を含めるのは、薬物やその代謝物に十分に曝露される組織を使用することにより遺伝毒性がないことを保証するためである；遺伝毒性を有すると判断される発がん物質のいくつかは肝臓を用いる試験では陽性結果を示すが、骨髄を用いるin vivo 細胞遺伝学的試験では陰性を示すことがある。これらの例は、適切な代謝活性化能の欠如又は活性中間体が骨髄の血液系細胞には到達していないことを反映したものであろう。
DNA 鎖切断試験、DNA 付加体試験及び導入遺伝子の突然変異試験は多くの組織に適用できるという利点がある。それらすべてのin vivo 試験について、国際的に合意されたプロトコールはまだないが、UDS 試験に加え、DNA 鎖切断試験（コメット試験及びアルカリ溶出試験）、DNA 付加体（共有結合）測定及びげっ歯類を用いたトランスジェニック遺伝子突然変異試験に関する多数の公表データや、推奨されるプロトコールがある。
MLA で陽性を示し、主に大きなコロニーを誘発するが、in vitro 分裂中期細胞試験で染色体切断を示さない化合物に対しては、トランスジェニックマウス遺伝子突然変異試験のようなin vivo 突然変異試験がDNA 鎖切断試験よりも優先度が高いと考えられる。
UDS 試験は、大きなDNA 付加体を誘発、あるいは細胞を用いる復帰突然変異（エームス）試験陽性の化合物に対して有用と考えられる。
細胞毒性はDNA 鎖切断を誘発するため、DNA 鎖切断試験の結果から混乱を招かぬよう注意深い細胞毒性評価が必要である。細胞毒性の問題は、in vitro アルカリ溶出試験では十分にその特性が評価されているが（Storer ら、1996）、コメット試験では完全には評価されていない。原則として、DNA 鎖切断試験を反復投与毒性試験で行う場合は適切な用量設定と採取時間が重要である。
成熟動物の肝臓は分裂が盛んな組織ではないことから、第2 の試験としては非細胞遺伝学的指標が汎用される。しかし、部分肝切除や幼若ラット（Hayashi ら、2007）などの利用により肝細胞の分裂が認められれば、肝臓を用いた小核試験は実施可能であり、既知の遺伝毒性物質を検出できる。
13. メチルセルロース水溶液に代表されるような水溶性溶媒では通常問題ないが、Tween 80のような溶媒では反復投与可能な容量は単回投与の30 分の1 程度である。
14. 毒性試験において、曝露の測定などの目的で追加の採血が計画されている場合には注意を要する。そうした失血が小核試験結果に影響を与えることがある。すなわち、失血により刺激された赤血球の新生が小核を有する赤血球を増加させることがある。
15. 小核の増加は、遺伝毒性物質を投与しなくても赤血球生成障害（再生性貧血；髄外造血など）、ストレス、低体温及び高体温により生ずる（Tweats らによる総説、2007,I）。血液中では、脾臓の機能変化が血液からの小核含有赤血球細胞の除去に影響を及ぼし、循環する小核含有赤血球の増加をきたすと考えられる。
16. 短期試験あるいは反復投与毒性試験における陽性対照：小核（及びその他の細胞遺伝学的）試験における陽性対照の目的は、標本観察者が小核の増加を間違いなく検出できることを証明することである。これには、陽性対照を短期投与した少数の動物（片性で可）を用いる定期的な試験（数ヵ月毎）から採取したサンプルを使用すればよい。マニュアル計測では、このようなスライドを各試験で観察するコード化したスライドに加えることが可能である。陽性対照のスライドは、その染色特性や小核頻度によって標本観察者に容易に識別されてはならない。自動計測では、各試験で適切な品質保証対照サンプルを使用する。
他のin vivo 遺伝毒性試験における陽性対照の目的は、選択した動物種、組織及びプロトコールによる試験がDNA 損傷／変異原性の増加を間違いなく検出できることを証明することである。試験施設が、複数回の独立した試験において適切な陽性対照物質を常に検出可能であることを証明すれば、一般的には陽性対照と被験物質の実験条件も変わらないことを十分に示している。しかしながら、現在のところ、コメット試験では同時の陽性対照をおくことが望ましいと考えられる。
17. 小核の誘発が主に染色体損失によるものか、又は染色体切断によるものかを証明するには、動原体の存在を確認するために、in vitro 又はin vivo での小核の染色が有効である。
例えば、動原体部位のDNA 塩基配列プローブを用いるin situ 蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）又はキネトコア蛋白への標識抗体を使用する。誘発された小核の大部分が動原体陽性であれば、染色体損失が示唆される（コルヒチン及びビンブラスチンのような強力なチュブリン重合阻害物質でも100％のキネトコア陽性小核を生ずることはなく、大体70～80％程度であるが、リスク評価の際はまず異数性誘発物質として認められている。）。代替法として、分裂中期の構造異常を調べるin vitro 又はin vivo 試験がある；陰性であれば、小核の誘発は染色体損失に関連することを意味する。
18. 標準的な方法で誘導されたS9 mix は、ヒトS9 よりも高い活性化能を有し、特定の補因子が供給されない限り第2 相の代謝（解毒）能を欠いている。また、in vitro では高濃度の被験物質の場合、非特異的な活性化が生ずる可能性がある（Kirkland ら、2007）。ヒトS9 又は他のヒトに関連した代謝活性化系を用いた遺伝毒性試験は有用である。前臨床試験で用いた動物種（非誘導のミクロゾーム、肝細胞又はin vivo 組織を含む。）又はヒト試料における既知の代謝物プロファイルと、遺伝毒性試験の代謝物プロファイルを解析し、比較する事も試験結果の関連性を判断するのに有用であり（Ku ら、2007）、その追加試験では通常、肝臓を用いたin vivo 試験に焦点を当てる。S9 存在下のin vitro 試験で陽性結果を示す化合物がin vivo では遺伝毒性を誘発しない可能性があり、それは、in vitro で生成される代謝物がin vivo では生成されないか、生成されても極めて少量の場合又は代謝的に解毒されるか若しくは速やかに排泄されるためであり、このような場合、in vivoではリスクがないことを示唆している。

1. The in vitro micronucleus assay has been widely evaluated in international collaborative studies (Kirsch-Volders et al., 2003), is validated by ECVAM (Corvi et al., 2008), and is the subject of an OECD guideline 487 (2010).
2. There is a small but significant number of genotoxic carcinogens that are reliably detected by the bone marrow tests for chromosomal damage but have yielded negative/weak/conflicting results in the in vitro tests outlined in the standard battery options. Carcinogens such as procarbazine, hydroquinone, urethane and benzene fall into this category. Some other examples from a survey of companies are described by Tweats et al., 2007, II.
3. In principle, micronuclei in hematopoietic cells can be evaluated in bone marrow from any species, and in blood from species that do not filter out circulating micronucleated erythrocytes in the spleen. In laboratory mice, micronuclei can be measured in polychromatic erythrocytes in blood, and mature (normochromatic) erythrocytes can be used when mice are treated continuously for about 4 weeks or more. Although rats rapidly remove micronucleated erythrocytes from the circulation, it has been established that micronucleus induction by a range of clastogens and aneugens can be detected in rat blood reticulocytes (Wakata et al., 1998; Hamada et al., 2001). Rat blood can be used for micronucleus analysis provided methods are used to ensure analysis of the newly formed reticulocytes (Hayashi et al., 2007; MacGregor et al., 2006), and the sample size is sufficiently large to provide appropriate statistical sensitivity given the lower micronucleus levels in rat blood than in bone marrow (Kissling et al., 2007). Whichever method is chosen, bone marrow or blood, automated or manual analysis, each laboratory should determine the appropriate minimum sample size to ensure that scoring error is maintained below the level of animal-to-animal variation.
Some experience is now available for micronucleus induction in the dog and rhesus monkey (Harper et al., 2007; Hotchkiss et al., 2008). One example where such alternative species might be useful would be in evaluation of a human metabolite that was not sufficiently represented in rodents but was formed in the dog or monkey.
4. While the two options in the battery are equally suitable, specific knowledge about an individual test compound can indicate that one option is preferable. For example, if systemic exposure in animal models is equal to or less than anticipated clinical exposure, in vitro assays should be employed: Option 1 (see also Sections 2.3.4 and 4.4.1). On the other hand Option 2, including a test in liver, is recommended in cases where short-lived reactive metabolites are expected to be generated in the liver.
5. Certain structurally alerting molecular entities are recognized as being causally related to the carcinogenic and/or mutagenic potential of chemicals. Examples of structural alerts include alkylating electrophilic centers, unstable epoxides, aromatic amines, azo-structures, N-nitroso groups, and aromatic nitro-groups (Ashby and Paton, 1994). For some classes of compounds with specific structural alerts, it is established that specific protocol modifications/additional tests are important for optimum detection of genotoxicity (e.g., molecules containing an azo-group, glycosides, compounds such as nitroimidazoles requiring nitroreduction for activation, compounds such as phenacetin requiring a different rodent S9 for metabolic activation).
6. There is some experience with in vivo assays for micronucleus induction in skin and colon (Hayashi et al., 2007), and DNA damage assays in these tissues can also be an appropriate substitute.
7. A few chemicals are more easily detectable either with plate-incorporation or with pre-incubation methods, though differences are typically quantitative rather than qualitative (Gatehouse et al., 1994). Experience in the pharmaceutical industry where drugs have been tested in both protocols has not resulted in different results for the two methods, and, in the IWGT report (Gatehouse et al., 1994), the examples of chemical classes listed as more easily detectable in the pre-incubation protocol are generally not pharmaceuticals and are positive in in vivo genotoxicity tests in liver. These include short chain aliphatic nitrosamines; divalent metals; aldehydes (e.g., formaldehyde, crotonaldehyde); azo dyes (e.g., butter yellow); pyrrolizidine alkaloids; allyl compounds (allylisothiocyanate, allyl chloride), and nitro (aromatic, aliphatic) compounds.
8. The rationale for a maximum concentration of 1 mM for in vitro mammalian cell assays includes the following: The test battery includes the Ames test and an in vivo assay. This battery optimizes the detection of genotoxic carcinogens without relying on any individual assay alone. There is a very low likelihood of compounds of concern (DNA damaging carcinogens) that are not detected in Ames test or in vivo genotoxicity assay, but are detectable in an in vitro mammalian assay only above 1 mM. Second, a limit of 1 mM maintains the element of hazard identification, being higher than clinical exposures to known pharmaceuticals, including those that concentrate in tissues (Goodman & Gilman, 2001), and is also higher than the levels generally achievable in preclinical studies in vivo. Certain drugs are known to require quite high clinical exposures for therapeutic effect, e.g., nucleoside analogs and some antibiotics. While comparison of potency with existing drugs can be of interest to sponsors, perhaps even above the 1 mM limit, it is ultimately the in vivo tests that determine relevance for human safety. For pharmaceuticals with unusually low molecular weight (e.g., less than 200) higher test concentrations should be considered.
9. Although some genotoxic carcinogens are not detectable in in vitro genotoxicity assays unless the concentrations tested induce some degree of cytotoxicity, DNA damaging agents are generally detectable with only moderate levels of toxicity (Greenwood et al., 2004). As cytotoxicity increases, mechanisms other than direct DNA damage by a compound or its metabolites can lead to ‘positive’ results that are related to cytotoxicity and not genotoxicity. Such indirect induction of DNA damage secondary to damage to non-DNA targets is more likely to occur above a certain concentration threshold. The disruption of cellular processes is not expected to occur at lower, pharmacologically relevant concentrations.
In cytogenetic assays, even weak clastogens that are known to be carcinogens are positive without exceeding a 50% reduction in cell counts. On the other hand, compounds that are not DNA damaging, mutagenic or carcinogenic can induce chromosome breakage at toxic concentrations. For both in vitro cytogenetic assays, the chromosome aberration assay and the in vitro micronucleus assay, a limit of about 50% growth reduction is considered appropriate.
For cytogenetic assays in cell lines, measurement of cell population growth over time (by measuring the change in cell number during culture relative to control, e.g., by the method referred to as Population Doubling (PD; Note 10), has been shown to be a useful measure of cytotoxicity, as it is known that cell numbers can underestimate toxicity. For lymphocyte cultures, an inhibition of proliferation not exceeding about 50% is considered sufficient; this can be measured by Mitotic Index (MI) for metaphase aberration assays and by an index based on cytokinesis block for in vitro micronucleus assays. In addition, for the in vitro micronucleus assay, since micronuclei are scored in the interphase subsequent to a mitotic division, it is important to verify that cells have progressed through the cell cycle. This can be done by use of cytochalasin B to allow nuclear division but not cell division, so that micronuclei can be scored in binucleate cells (the preferred method for lymphocytes). For cell lines, other methods to demonstrate cell proliferation, including cell population growth over time (PD) as described above, can be used (Kirsch-Volders et al., 2003).
For MLA, appropriate sensitivity is achieved by limiting the top concentration to one with close to 20% Relative Total Growth (RTG) (10-20%) both for soft agar and for microwell methods (Moore et al., 2002). Reviews of published data using the current criteria found very few chemicals that were positive in MLA only at concentrations with less than 20% RTG and that were rodent carcinogens, and convincing evidence of genotoxic carcinogenesis for this category is lacking. The consensus is that caution is appropriate in interpreting results when increases in mutation are seen only below 20% RTG, and a result would not be considered positive if the increase in mutant fraction occurred only at ≤ 10% RTG.
In conclusion, caution is appropriate in interpreting positive results obtained as reduction in growth/survival approaches or exceeds 50% for cytogenetics assays or 80% for MLA. It is acknowledged that the evaluation of cells treated at these levels of cytotoxicity/clonal survival can result in greater sensitivity but bears an increased risk of non-relevant positive results. The battery approach for genotoxicity is designed to ensure appropriate sensitivity without relying on single in vitro mammalian cell tests at high cytotoxicity.
To obtain an appropriate toxicity range, a preliminary range-finding assay over a broad range of concentrations is useful, but in the genotoxicity assay it is often critical to use multiple concentrations that are spaced quite closely (less than two–fold dilutions). Extra concentrations can be tested but not all concentrations need be evaluated for genotoxicity. It is not intended that multiple experiments be carried out to reach exactly 50% reduction in growth, for example, or exactly 80% reduction in RTG.
10. For in vitro cytogenetic assays it is appropriate to use a measure of relative cell growth to assess toxicity, because cell counts can underestimate toxicity (Greenwood et al., 2004). Using calculated population doublings (see Glossary) to estimate the 50% growth reduction level, it was demonstrated that the frequency of positive results with compounds that are not mutagenic or carcinogenic is reduced, while agents that act via direct interaction with DNA are reliably positive.
11. In certain cases it can be useful to examine chromosome aberrations at metaphase in lymphocytes cultured from test animals after one or more administrations of test compound, just as bone marrow metaphase cells can be used. Since circulating lymphocytes are not replicating, agents that require replication for their genotoxic effect (e.g., some nucleoside analogs) are not expected to be detected in this cell type. Because some lymphocytes are relatively long-lived, in principle there is the potential for accumulation of un-repaired DNA damage in vivo that would give rise to aberrations when the cells are stimulated to divide in vitro. The in vivo lymphocyte assay can be useful in following up indications of clastogenicity, but in general another tissue such as liver is a more informative supplement to the micronucleus assay in hematopoietic cells because exposure to drug and metabolite(s) is often higher in liver.
12. The inclusion of a second in vivo assay in the battery is to provide assurance of lack of genotoxicity by use of a tissue that is well exposed to a drug and/or its metabolites; a small number of carcinogens that are considered genotoxic gave positive results in a test in liver but were negative in a cytogenetics assay in vivo in bone marrow. These examples likely reflect a lack of appropriate metabolic activity or lack of reactive intermediates delivered to the hematopoietic cells of the bone marrow.
Assays for DNA strand breaks, DNA adducts, and mutations in transgenes have the advantage that they can be applied in many tissues. Internationally agreed protocols are not yet in place for all the in vivo assays, although considerable experience and published data and protocol recommendations exist for DNA strand break assays (Comet and alkaline elution assays), DNA adduct (covalent binding) measurements, and transgenic rodent mutation assays, in addition to the UDS assay. For a compound that is positive in vitro in the MLA and induces predominantly large colonies, and is also shown not to induce chromosome breakage in an in vitro metaphase assay, an in vivo assay for mutation, such as a transgenic mouse mutation assay, should be considered in preference to a DNA strand break assay. The UDS assay is considered useful mainly for compounds that induce bulky DNA adducts or are positive in the Ames test. Because cytotoxicity induces DNA strand breakage, careful cytotoxicity assessment is needed to avoid confounding the results of DNA strand break assays. This has been well characterized for the in vitro alkaline elution test (Storer et al., 1996) but not yet fully validated for the Comet assay. In principle the DNA strand break assays can be used in repeat-dose toxicology assays with appropriate dose levels and sampling times.
Since liver of mature animals is not a highly mitotic tissue, often a non-cytogenetic endpoint is used for the second assay, but when dividing hepatocytes are present, such as after partial hepatectomy, or in young rats (Hayashi et al., 2007), micronucleus analysis in liver is possible, and detects known genotoxic compounds.
13. For common vehicles like aqueous methyl cellulose this would usually be appropriate, but for vehicles such as Tween 80, the volume that can be administered could be as much as 30 fold lower than that given acutely.
14. Caution is appropriate if the toxicological study design includes additional blood sampling, e.g., for measurement of exposure. Such bleeding could perturb the results of micronucleus analysis since erythropoiesis stimulated by bleeding can lead to increases in micronucleated erythrocytes.
15. Increases in micronuclei can occur without administration of any genotoxic agent, due to disturbance in erythropoiesis (such as regenerative anemia; extramedullary hematopoiesis), stress, and hypo- and hyperthermia (reviewed by Tweats et al., 2007, I). In blood, changes in spleen function that affect clearance of micronucleated cells from the blood could lead to small increases in circulating micronucleated red blood cells.
16. Positive controls for either short-term or repeat dose genotoxicity studies:
For micronucleus (and other cytogenetic) assays, the purpose of the positive control is to verify that the individuals scoring the slides can reliably detect increases in micronuclei. This can be accomplished by use of samples from periodic studies (every few months) of small groups of animals (one sex) given acute treatment with a positive control. For manual scoring such slides can be included in coded slides scored from each study. Positive control slides should not be obvious to readers based on their staining properties or micronucleus frequency. For automated scoring, appropriate quality control samples should be used with each assay.
For other in vivo genotoxicity assays, the purpose of positive controls is to demonstrate reliable detection of an increase in DNA damage/mutagenicity using the assay in the chosen species, tissue and protocol. After a laboratory has demonstrated that it can consistently detect appropriate positive control compounds in multiple independent experiments, carrying out positive control experiments periodically is generally sufficient provided experimental conditions are not changed. However, currently it is considered that for the Comet assay concurrent positive controls are advisable.
17. Determination of whether micronucleus induction is due primarily to chromosome loss or to chromosome breakage could include staining micronuclei in vitro or in vivo to determine whether centromeres are present, e.g., using Fluorescent in situ Hybridization (FISH) with probes for DNA sequences in the centromeric region, or a labeled antibody to kinetochore proteins. If the majority of induced micronuclei are centromere positive, this suggests chromosome loss. (Note that even potent tubule poisons like colchicine and vinblastine do not produce 100% kinetochore positive micronuclei, but more typically 70 to 80%, and are accepted as primarily aneugens for assessing risk). An alternative approach is to carry out an in vitro or in vivo assay for metaphase structural aberrations; if negative this would imply that micronucleus induction is related to chromosome loss.
18. Standard induced S9 mix has higher activation capacity than human S9, and lacks phase two detoxification capability unless specific cofactors are supplied. Also, non-specific activation can occur in vitro with high test substrate concentrations (see Kirkland et al., 2007). Genotoxicity testing with human S9 or other human-relevant activation systems can be helpful. Analysis of the metabolite profile in the genotoxicity test incubations for comparison with known metabolite profiles in preclinical species (in uninduced microsomes or hepatocytes, or in vivo) or in preparations from humans can also help determine the relevance of test results (Ku et al., 2007), and follow-up studies will usually focus on in vivo testing in liver. A compound that gives positive results in vitro with S9 might not induce genotoxicity in vivo because the metabolite is not formed, is formed in very small quantities, or is metabolically detoxified or rapidly excreted, indicating a lack of risk in vivo.

アルカリ溶出試験（Alkaline elution assay）： DNA 鎖切断試験を参照。
異数性（Aneuploidy）： 細胞あるいは生物種に固有な染色体基本数からずれていること。
塩基対置換（Base substitution）： 塩基配列において1 つ以上の塩基が他の塩基と置き換わっていること。これにより元のものとは異なるたん白質が合成される可能性がある。
細胞増殖（Cell proliferation）： 細胞分裂して娘細胞をつくる能力。
動原体／キネトコア（Centromere/kinetochore）： 姉妹染色分体の接着及び娘染色体の極への移動と娘核への封入を確実にする紡錘糸の付着に重要な染色体の構造。
染色体（構造）異常誘発物質（Clastogen）： 染色体の構造的切断を引き起こす物質で、通常光学顕微鏡で検出可能。
コロニー形成率（Cloning efficiency）： 1 個の細胞がクローンを形成する割合。通常少量の細胞を適切な培養条件下で播種した後に測定する。
コメット試験（Comet assay）： DNA 鎖切断試験を参照。
培養飽和密度（Culture confluency）： 目視検査による培養における細胞密度の飽和状態。
細胞遺伝学的評価（Cytogenetic evaluation）： 有糸分裂及び減数分裂における染色体構造の光学顕微鏡による解析、あるいは小核の解析。
DNA 付加体（DNA adduct）： 化学物質とDNA が共有結合した生成物。
DNA 修復（DNA repair）： DNA 損傷後の本来のDNA 配列への再構成。
DNA 鎖切断（DNA strand breaks）： DNA の単鎖あるいは二本鎖切断。
DNA 鎖切断試験（DNA strand break assay）： アルカリ処理により、特定の型のDNA 損傷が一本鎖切断に転換される。これらはフィルターを通過する移動率を測定するアルカリ溶出試験、単細胞ゲル電気泳動試験又はコメット試験（スライドガラス上に単層ゲルを重層し、そこに包埋された細胞に電流をあて、電気泳動する方法。DNA の短い断片が核の外側に移動し、「彗星の尾」の様な像を呈し、DNA の移動した程度は、細胞を染色することにより顕微鏡下で計測する。）で検出可能である。
フレームシフト突然変異（Frameshift mutation）： 遺伝子の塩基配列に1 個又は2 個の塩基が付加（挿入）又は欠失した突然変異（遺伝コードの変化）。これにより、元のものとは異なる、又は短い蛋白質が合成される可能性がある。
遺伝子突然変異（Gene mutation）： 単一の遺伝子又はその調節遺伝子の配列内に生じた恒久的な変化。変化としては点突然変異、挿入、欠失などがある。
遺伝的指標（Genetic endpoint）： 対象とする遺伝的変化の型又はそのクラス（例えば、遺伝子突然変異、染色体異常、DNA 鎖切断、DNA 修復、DNA 付加体の生成など）
遺伝毒性（Genotoxicity）： 誘発の機序に関係なく、遺伝物質に生じた有害な変化の総称。
小核（Micronucleus）： 細胞質中の核DNA の粒子：染色体全体又は染色体断片を含んでいる。
分裂指数（Mitotic index）： 染色体標本（スライド）において、細胞分裂していない（間期）細胞を含む全細胞中に占める各段階の分裂細胞の割合。
染色体の数的変化（Numerical chromosome changes）： 固有の一倍体あるいは二倍体の染色体数から染色体の数が変化していること；株細胞では、染色体数のモード値から外れていること。
プラスミド（Plasmid）： バクテリアの通常の遺伝子とは別の微小遺伝子。プラスミドは宿主の遺伝子に挿入されるか、染色体外の微小遺伝子として存在する。
点突然変異（Point mutations）： 遺伝コードの変化のことで、通常は単一のDNA 塩基対に限定される。
多染性赤血球（Polychromatic erythrocyte）： 細胞分化の途中にあるリボゾームを持つ未成熟な赤血球で、成熟した正染色性赤血球（リボゾームを欠く）とはRNA の特異染色により容易に判別ができる。
倍数性（Polyploidy）： 染色体のモード値の数的な異常、半数体数のおよその倍数。核内倍加は、分裂中期に染色体の対が「二重染色体」として結合している状態を意味する。
細胞集団倍加あるいは培養増殖（Population doubling or culture growth）： これはいくつかの方法で算出されうる；適切な計算式の一例を示す：集団倍加＝処理開始時の細胞数（初期値）（X0）に対する最終時の細胞数（N）の割合を対数化し、2 の対数で割った値。PD＝[log(N÷X0)] ÷log 2
組換え（Recombination）： DNA 切断とそれに続く均衡あるいは不均衡な再結合。
RTG（相対総増殖率）（RTG [relative total growth]）： この細胞毒性の計算値は、被験物質処理後の細胞増加率（処理開始から処理後2 日目までの細胞損失及び細胞増殖に基づく計算値）と処理後2 日の細胞生存率の積により求められる。
単細胞ゲル電気泳動試験（Single cell gel electrophoresis assay）： コメット試験。DNA 切断試験を参照。
生存（率）（変異原性試験における）（Survival [in the context of mutagenicity testing]）： 死細胞を含む全細胞に占める生存細胞の割合で、通常、ある期間の処理後、細胞染色法あるいはコロニー形成法により求める。
導入遺伝子（Transgene）： 体細胞や生殖系列細胞の宿主遺伝子に組み込まれた外来の遺伝子。
不定期DNA 合成試験（UDS）（Unscheduled DNA synthesis [UDS]）： DNA 損傷によって誘発されるS 期以外のDNA 合成。通常DNA 除去修復と関連している。

Alkaline elution assay: See DNA strand break assay.
Aneuploidy: Numerical deviation of the modal number of chromosomes in a cell or organism.
Base substitution: The substitution of one or more base(s) for another in the nucleotide sequence. This can lead to an altered protein.
Cell proliferation: The ability of cells to divide and to form daughter cells.
Centromere/kinetochore: Structures in chromosomes essential for association of sister chromatids and for attachment of spindle fibers that move daughter chromosomes to the poles and ensure inclusion in daughter nuclei.
Clastogen: An agent that produces structural breakage of chromosomes, usually detectable by light microscopy.
Cloning efficiency: The efficiency of single cells to form clones. It is usually measured after seeding low numbers of cells in a suitable environment.
Comet assay: See DNA strand break assay.
Culture confluency: A quantification of the cell density in a culture by visual inspection.
Cytogenetic evaluation: Chromosome structure analysis in mitosis or meiosis by light microscopy or micronucleus analysis.
DNA adduct: Product of covalent binding of a chemical to DNA.
DNA repair: Reconstitution of the original DNA sequence after DNA damage.
DNA strand breaks: Single or double strand scissions in the DNA.
DNA strand break test: Alkaline treatment that converts certain types of DNA lesions into strand breaks that can be detected by the alkaline elution technique, measuring migration rate through a filter, or by the single cell gel electrophoresis or Comet test (in which cells embedded in a thin layer of gel on a microscope slides are subjected to electric current, causing shorter pieces of DNA to migrate out of the nucleus into a “Comet tail”). The extent of DNA migration is measured visually under the microscope on stained cells.
Frameshift mutation: A mutation (change in the genetic code) in which one base or two adjacent bases are added to (inserted in) or deleted from the nucleotide sequence of a gene. This can lead to an altered or truncated protein.
Gene mutation: A detectable permanent change within a single gene or its regulating sequences. The changes can be point mutations, insertions, or deletions.
Genetic endpoint: The precise type or class of genetic change investigated (e.g., gene mutations, chromosomal aberrations, DNA strand breaks, DNA repair, DNA adduct formation, etc).
Genotoxicity: A broad term that refers to any deleterious change in the genetic material regardless of the mechanism by which the change is induced.
Micronucleus: Particle in a cell that contains nuclear DNA; it might contain a whole chromosome(s) or a broken centric or acentric part(s) of chromosome(s).
Mitotic index: Percentage of cells in the different stages of mitosis amongst the cells not in mitosis (interphase) in a preparation (slide).
Numerical chromosome changes: Chromosome numbers different from the original haploid or diploid set of chromosomes; for cell lines, chromosome numbers different from the modal chromosome set.
Plasmid: Genetic element additional to the normal bacterial genome. A plasmid might be inserted into the host chromosome or form an extra-chromosomal element.
Point mutations: Changes in the genetic codes, usually confined to a single DNA base pair.
Polychromatic erythrocyte: An immature erythrocyte in an intermediate stage of development that still contains ribosomes and, as such, can be distinguished from mature normochromatic erythrocytes (lacking ribosomes) by stains selective for RNA.
Polyploidy: Numerical deviation of the modal number of chromosomes in a cell, with approximately whole multiples of the haploid number. Endoreduplication is a morphological form of polyploidy in which chromosome pairs are associated at metaphase as “diplochromosomes”.
Population doubling or culture growth: This can be calculated in different ways; one example of an appropriate formula is: Population doublings (PDs) = the log of the ratio of the final count (N) to the starting (baseline) count (Xo), divided by the log of 2. That is: PD = [log(N ÷ Xo)] ÷ log 2.
Recombination: Breakage and balanced or unbalanced rejoining of DNA.
RTG (relative total growth): This measure of cytotoxicity takes the relative suspension growth (based on cell loss and cell growth from the beginning of treatment to the second day post-treatment) and multiplies it by the relative plating efficiency at the time of cloning for mutant quantization.
Single Cell Gel Electrophoresis assay: Comet assay. See DNA strand break assay.
Survival (in the context of mutagenicity testing): Proportion of living cells among dead cells, usually determined by staining or colony counting methods after a certain treatment interval.
Transgene: An exogenous or foreign gene inserted into the host genome, either into somatic cells or germ line cells.
Unscheduled DNA synthesis (UDS): DNA synthesis that occurs at some stage in the cell cycle other than S-phase in response to DNA damage. It is usually associated with DNA excision repair.